肿瘤坏死因子-α诱导蛋白8样分子1在食管癌中的表达及其作用机制研究

王道军，赵山虎，夏平，吴应虎

食管癌是居全球癌症死亡第六位的恶性肿瘤，发病率呈上升趋势[1]。而且我国食管癌的病死率居世界首位，患者早期症状不典型，一旦确诊常处于晚期，总体5年生存率不到10%[2-3]。肿瘤坏死因子-α诱导蛋白8样分子1(TNF-α-induced protein 8-like 1，TIPE1)是一种与细胞凋亡密切相关的蛋白，在多种肿瘤疾病中异常表达，并与肿瘤的发生发展密切相关，因此逐渐成为抗肿瘤药物的研究热点。目前研究显示TIPE1在肺癌、肝癌、骨肉瘤、胃癌组织中低表达[4-6]，而在食管癌组织中表达情况未知，因此本研究将探讨TIPE1在食管癌组织中的表达及相关机制，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)标本来源：2018年1月—2019年1月陕西省安康市中医医院肿瘤外科手术切除食管癌患者10例，留取癌组织及癌旁正常组织备用。术前患者未进行化放疗，且均经过病理学、影像学确诊。(2)细胞株：食管癌细胞Eca109购自中国科学院细胞库。(3)试剂及主要仪器：兔抗CyclinD1、CyclinB1、cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 8、MMP-2、MMP-9及GAPDH多克隆抗体购自美国cell signal technology公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)、CCK-8试剂盒、BCA试剂盒购自南京凯基生物技术有限公司；胎牛血清、DMEM培养基、胰蛋白酶购自美国Gbico公司；TIPE1空白质粒及过表达载体购自上海吉玛生物有限公司；LipofectamineTM3000，ranswell 小室购自美国Corning公司。TE2000荧光倒置显微镜购自日本Nikon公司；电泳仪、转印电泳仪及ChemiDocTM XRS凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司。

1.2 观测指标与方法

1.2.1 TIPE1过表达载体的转染：室温条件下Opti-MEM培养基分别与LipofectamineTM3000、TIPE1空白质粒及过表达载体稀释混匀后，再将稀释好的LipofectamineTM3000分别与稀释好的TIPE1空白质粒及过表达载体混匀，于室温下放置30 min，使其形成复合物。然后将复合物加入生长融合度达到70%的Eca109细胞中，培养6 h，换新鲜培养液培养至48 h，最后采用Western-blot法检测细胞中TIPE1的表达。

1.2.2 CCK-8检测Eca109细胞活力：将Eca109细胞5×103个接种于96孔板，细胞汇合度达到50%左右后，进行转染48 h，加入CCK-8，继续培养4 h，应用酶标仪于570 nm处测定吸光度，吸光度即代表细胞的活力。

1.2.3 流式细胞术检测Eca109细胞凋亡：将Eca109细胞铺于6孔板，待细胞贴壁后，转染培养48 h，每组收集1×106/ml个细胞，400 μl的1×Binding Buffer重悬细胞，加入Annexin V-FITC 5 μl在4℃条件下避光孵育15 min，PI染液加入10 μl在4℃条件下避光孵育15 min，并以流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.4 流式细胞术检测Eca109细胞周期：将Eca109细胞铺于6孔板，待细胞贴壁后，转染培养48 h，每组收集1×106/ml个细胞，预冷PBS重悬细胞，1 ml的DNA染色液及10 μl的PI染色液加入到细胞中混匀后，在室温下避光孵育30 min，上流式细胞仪检测各细胞周期所占的比例。

1.2.5 Transwell实验检测Eca109细胞侵袭能力：将matrigel胶平铺到transwell小室备用。将1×104个Eca109细胞接种于6孔板，细胞汇合度达到50%左右后，转染48 h，将细胞消化并接种到transwell上室，下室仅含有10%DMEM培养基，48 h后，将小室取出对下室进行染色，首先行多聚甲醛固定10 min，然后结晶紫室温避光染色15 min，最后在倒置显微镜下对下室的5个视野中的细胞数目进行计数，取平均值，以细胞侵袭数目代表细胞的侵袭能力。

1.2.6 Western-blot检测细胞中CyclinD1、CyclinB1、cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 8、MMP-2、MMP-9蛋白表达量：收集Eca109细胞，加入含有PMSF的细胞裂解液裂解细胞30 min，1 000 r/min、4℃离心15 min，收集上清液，上清液即总蛋白。采用BCA试剂盒测定蛋白浓度，蛋白定量，制作蛋白浓缩胶和分离胶并室温静置30 min后，取30 μg蛋白样品上样，进行凝胶电泳1～2 h，转聚偏二氟乙烯膜30～40 min。2% BSA室温下孵育1 h，兔抗(CyclinD1、CyclinB1、cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 8、MMP-2、MMP-9及GAPDH多克隆抗体)一抗溶液4℃过夜孵育，TBST洗涤3次，次日室温孵育二抗，TBST洗涤3次，滴加化学曝光液，于凝胶成像系统中曝光，并分析各目的蛋白灰度值。实验重复3次取平均值。

2 结 果

2.1 TIPE1在食管癌组织及癌旁正常组织中的表达 TIPE1在癌旁正常组织及食管癌组织中蛋白表达量分别为(0.34±0.02)和(0.13±0.01)，二者比较差异具有统计学意义(t=29.698,P=0.000)，见图1。

图1 TIPE1在食管癌组织及癌旁正常组织的表达

2.2 TIPE1过表达对Eca109细胞中TIPE1表达量的影响 TIPE1过表达载体及空白质粒在Eca109细胞中表达量分别为(1.02±0.10)和(0.21±0.02)，二者比较差异具有统计学意义(t=13.757,P=0.000)，见图2。

图2 TIPE1过表达对Eca109细胞中TIPE1表达量的影响

2.3 TIPE1过表达对Eca109细胞活力的影响 与空白质粒组(0.48±0.04)比较，TIPE1过表达组(0.38±0.03)细胞活力显著降低，差异有统计学意义(t=3.464，P=0.026)。

2.4 TIPE1过表达对Eca109细胞凋亡、细胞周期的影响 与空白质粒组比较，TIPE1过表达组细胞早期凋亡率及晚期凋亡率显著提高，G2期和S期细胞所占比例显著降低，而G1期细胞所占比例显著升高，细胞周期主要阻滞于G1期(P<0.05)，见表1。

2.5 TIPE1过表达对Eca109细胞侵袭能力的影响 与空白质粒组[(158.32±14.33)个]比较，TIPE1过表达组[(42.36±4.24)个]细胞侵袭数目显著减少(t=13.440，P=0.000)。

2.6 TIPE1过表达对Eca109细胞中CyclinD1、CyclinB1、cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 8、MMP-2、MMP-9蛋白表达量的影响 与空白质粒组比较，TIPE1过表达组中CyclinD1、CyclinB1、cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 8、MMP-2、MMP-9蛋白表达量均显著下调(t=10.457、10.922、52.034、46.540、11.585、13.555，P均=0.000)，见图3～5。

注：与空白质粒组比较，aP<0.01

图3 TIPE1过表达对Eca109细胞中CyclinD1、

CyclinB1蛋白表达量的影响

3 讨 论

肿瘤坏死因子α诱导蛋白8(TNFAIP8)家族是最新发现的由TNF-α诱导产生的一组蛋白，包括4个成员：TIPE，TIPE1、2、3[7-9]。其中TIPE1于2008年被首次发现，其基因定位于人染色体19p13.3，能够编码含有186个氨基酸的细胞质蛋白，表达于肝细胞、神经元细胞、生殖器细胞、肌肉细胞及各种来源的上皮细胞，特别是具有分泌功能的器官[10-11]。TIPE1在成熟的T、B淋巴细胞中不表达，而在人或者鼠来源的肿瘤细胞(HEK-293、RAW264.7、MOVAS等)中表达，提示TIPE1可能与肿瘤的发生有关[12-14]。目前研究表明TIPE1在肺癌、肝癌、骨肉瘤、胃癌组织中低表达，而在宫颈癌、皮肤癌组织中高表达[4-6]，说明TIPE1在肿瘤组织中的表达具有争议性，但TIPE1在食管癌组织中的表达作用未知，因此本课题组据此展开探讨。本研究Western-Blot实验结果表明，食管癌组织中TIPE1表达量低于癌旁正常组织，与TIPE1在大多数肿瘤组织中的表达趋势一致，说明TIPE1在食管癌的发生发展过程中起抑制作用[15-17]。

表1 TIPE1过表达对Eca109细胞凋亡、细胞周期的影响

注：与空白质粒组比较，aP<0.01

图4 TIPE1过表达对Eca109细胞中cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 8蛋白表达量的影响

注：与空白质粒组比较，aP<0.01

图5 TIPE1过表达对Eca109细胞中MMP-2、MMP-9蛋白表达量的影响

有学者通过生物信息学软件对TIPE1结构进行预测，结果发现TIPE1在哺乳动物中的氨基酸序列保守，并且能够与FBXW5及Caspase 8等蛋白分子相互作用[6，15]。另外有研究显示，siRNA干扰TIPE1能显著促进肝癌细胞的生长，而TIPE1过表达抑制肝癌细胞生长[15]。同时Wu等[17]的研究表明TIPE1能够通过下调非小细胞肺癌细胞A549及H292中MMP-2及MMP-9表达进而抑制肺癌细胞的侵袭转移；而Chen等[18]的研究也表明，TIPE1在骨肉瘤癌细胞中呈低表达，且TIPE1可通过抑制骨肉瘤细胞中MCP-1的表达来抑制巨噬细胞在骨肉瘤癌细胞的浸润。进而说明TIPE1对肿瘤细胞增殖、侵袭转移的调控作用。因此，本研究通过脂质体转染TIPE1过表达载体，并进一步探讨TIPE1过表达后对Eac109食管癌细胞增殖、细胞周期及细胞侵袭能力的影响，结果表明TIPE1过表达能够显著降低Eac109细胞活力，使细胞周期阻滞于G1期，同时还能够降低细胞的侵袭能力。

细胞的增殖与细胞周期密切相关，其中G1、G2、S期是常见抗肿瘤药物的作用靶点[19-21]，G1期是DNA复制前期，CyclinD1是与G1期最为密切相关的蛋白，其表达量在G1期达到顶峰，并促进G1迅速向S期转换。G2期是DNA合成后期，是有丝分裂准备前期，CyclinB1是与G2期密切相关的蛋白，其表达量在G2期达到顶峰，并启动有丝分裂相关因子表达。Caspase家族是一组能够使细胞发生程序性凋亡的天冬氨酸水解酶，受到上游凋亡信号刺激后，能使Caspase家族发生级联反应，起始凋亡蛋白Caspase 8将凋亡信号传递给凋亡蛋白执行者Caspase 3，并最终使DNA断裂，细胞发生凋亡[22-23]。细胞外基质的降解主要由蛋白水解酶MMPs所介导，其中MMP-2在降解细胞外基质的同时还能促进肿瘤细胞的血管生成并浸润[24]。MMP-9是分子量最大的MMPs，能够降解包括胶原在内的大多数细胞外基质，进而提供细胞的活动能力[25]。因此，本研究继续探讨TIPE1过表达对细胞中CyclinD1、CyclinB1、cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 8、MMP-2及MMP-9表达量的影响，结果表明TIPE1过表达能显著下调Eac109细胞中CyclinD1、CyclinB1、cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 8、MMP-2及MMP-9表达，进而降低细胞活力，并使细胞周期阻滞于G1期，抑制细胞侵袭。

综上所述，TIPE1在食管癌组织中低表达，提高TIPE1表达能显著下调CyclinD1、CyclinB1、cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 8、MMP-2及MMP-9表达，进而降低Eca109细胞活力及侵袭能力，并使细胞周期阻滞于G1期，从而说明TIPE1可能作为一个抑癌基因参与食管癌的发生发展，通过过表达TIPE1抑制食管癌细胞恶性生物学行为，可能作为食管癌治疗的有效措施，进而为TIPE1作为食管癌基因治疗靶点提供理论依据。