妊娠晚期孕妇B族链球菌实时荧光定量PCR检测结果分析

刘沃满　唐玉芬　李祝坤

[摘要]目的 應用实时荧光定量PCR（realtime PCR）方法检测妊娠晚期孕妇B族链球菌（GBS），了解妊娠晚期孕妇GBS的感染情况，为预防GBS感染提供依据。方法 选取2017年1月～2018年12月我院进行GBS检测的10 691例孕妇。采用realtime PCR技术对孕妇阴道分泌物或阴道-直肠分泌物进行GBS检测，并对检测结果进行分析。结果 10 691例孕妇中GBS感染阳性1466例（13.71%）;阴道-直肠分泌物的阳性率（16.30%）高于阴道分泌物（9.18%），差异有统计学意义（χ2=106.139，P=0.000）;孕晚期>30～34岁组阳性率最高（15.32%），与≤20岁组阳性率（6.36%）比较，差异有统计学意义（P<0.05），但与其他年龄组比较，差异无统计学意义（P>0.05）;四季间GBS阳性率差异无统计学意义（P>0.05）。结论 应用realtime PCR方法对围生期孕妇进行GBS筛查时，同时采集阴道和直肠分泌物联合检测，能明显提高GBS的检出率。GBS在妊娠晚期孕妇中的感染率较高，应加强对孕晚期孕妇的GBS筛检，阳性者及时采取干预措施，降低新生儿GBS感染，改善母婴结局。

[关键词]实时荧光定量PCR;B族链球菌;妊娠晚期;阳性率

[中图分类号] R714.25          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-4721（2019）10（c）-0138-03

[Abstract] Objective To apply real-time fluorescent quantitative PCR （realtime PCR） to detect group B Streptococcus （GBS） in pregnant women in the late pregnancy， and to understand GBS infection in pregnant women in the late pregnancy， so as to provide a basis for preventing GBS infection. Methods A total of 10 691 pregnant women undergoing GBS assay in our hospital from January 2017 and December 2018 were selected. GBS was detected in vaginal secretions or vaginal-rectal secretions of the pregnant women using realtime PCR， and the results were analyzed. Results Among the 10 691 pregnant women， 1466 women （13.71%） showed positive results in GBS infection. The positive rate （16.30%） of vaginal-rectal secretions was higher than that （9.18%） of vaginal secretions， with a statistically significant difference （χ2 =106.139， P=0.000）. The positive rate （15.32%） was the highest in pregnant women aged >30-34 years in the late pregnancy， and presented a statistically significant difference from the positive rate （6.36%） in pregnant women aged ≤20 years （P<0.05）. No statistically significant differences were found in the positive rate between pregnant women aged >30-34 years and pregnant women with other ages （P>0.05）. Conclusion The detection rate of GBS in pregnant women during the perinatal period can be significantly improved in GBS screening using realtime PCR and combined detection by collecting vaginal and rectal secretions simultaneously. The infection rate of GBS in pregnant women in the late pregnancy is relatively high. Therefore， GBS screening of pregnant women in the late pregnancy should be strengthened， and timely intervention measures should be taken in positive pregnant women to reduce GBS infection in newborns and improve maternal and infant outcomes.

[Key words] Real-time fluorescence quantitative PCR; B Streptococcus; Third trimester of pregnancy; Positive rate

B族链球菌（GBS）是一种革兰阳性球菌，学名是无乳链球菌（S.agalactiae），正常寄居于女性阴道和直肠。它是一种条件致病菌，一般正常健康人群感染GBS并不致病，但妊娠晚期孕妇感染GBS时，可引起早产、产后出血、胎膜早破、胎儿窘迫等不良妊娠结局[1]，还可通过垂直传播给新生儿[2]，引起新生儿肺炎、败血症及脑膜炎，造成新生儿死亡或神经系统后遗症。因此，进行产前GBS筛检显得尤为重要。本研究采用实时荧光定量PCR（realtime PCR）技术对妊娠晚期孕妇进行B族链球菌检测，以了解妊娠晚期孕妇带菌情况，为临床有效防治孕妇GBS感染提供依据，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料

选取2017年1月～2018年12月我院进行GBS检测的10 691例孕妇，其中阴道分泌物3889例，阴道-直肠分泌物有6802例。纳入标准：①孕龄34～39周;②年龄14～55岁;③所有孕妇均经B超检查确认为单胎。排除标准：①近期使用抗菌药物者;②产前明确胎儿畸形或死胎者;③合并严重心、肝、肾及免疫系统疾病者。本研究经我院医学伦理委员会批准和患者知情同意。

1.2方法

1.2.1主要试剂与仪器  采用上海之江生物科技股份有限公司的B族链球菌（GBS）核酸测定试剂盒（荧光PCR法），Bio Rad CFX96实时荧光定量PCR仪等。

1.2.2标本的处理与提取  分泌物：标本试管中加入1 ml无菌生理盐水，充分震荡摇匀，吸取液体转至1.5 ml离心管中（如分泌物较多，只取0.2 ml）13 000 r/min离心5 min。沉淀加无菌生理盐水1 ml震匀，13 000 r/min离心5 min，再重复洗涤1次。沉淀直接加入100 μl核酸提取液，充分混匀，99℃干浴10 min，13 000 r/min离心10 min，取上清4 μl作为PCR反应模板。对照品：取试剂盒配套的阳性对照品、阴性对照品各100 μl，分别加入100 μl核酸提取液，充分混匀，99℃干浴10 min，13 000 r/min离心10 min，取上清4 μl作为PCR反应模板。

1.2.3 PCR扩增  取试剂混合液36 μl分别置于PCR反应管中，将标本、阳性对照品、阴性对照品的核酸提取物各4 μl分别加入PCR反应管中，盖好管盖，瞬时离心，立即在Bio Rad CFX96实时荧光定量PCR仪进行扩增，反应条件为：37℃×2 min;再按93℃×15 s→60℃×60 s，循环40次;单点荧光检测在60℃。反应体系为40 μl。

1.2.4质量控制  阴性对照品检测结果为FAM通道Ct栏显示N/A，且VIC通道Ct值≤38;阳性对照品检测结果为FAM通道Ct值≤35，否则实验视为无效。

1.3观察指标及评价标准

利用荧光定量PCR仪配套软件进行自动分析，得到各样本和对照品（FCM）Ct值。在阴性对照品为Ct栏显示N/A，且VIC通道Ct值≤38，阳性对照品检测结果为Ct值≤35时，对各样本的结果判读如下：当样本Ct值≤38且有较好的对数增长曲线时，判定为GBS阳性;当样本Ct值为“Undet”或N/A或NoCt时，判定为GBS阴性（低于检测下限）;当样本38

1.4统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件对数据进行分析，计数资料以率表示，采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 GBS检出情况

在10 691例孕妇标本中，检出GBS阳性1466例，阳性率为13.71%。

2.2单独检测阴道分泌物和联合检测阴道-直肠分泌物结果的比较

单独检测阴道分泌物3889例，共检出GBS阳性357例，阳性率为9.18%;同时检测阴道-直肠分泌物6802例，共检出GBS阳性1109例，阳性率为16.30%，两组差异有统计学意义（χ2=106.139，P=0.000）。

2.3各年龄组妊娠晚期孕妇GBS阳性率的比较

各年龄组妊娠晚期孕妇GBS阳性率中，以>30～34岁组阳性率最高（15.32%），与≤20岁组比较，差异有统计学意义（P<0.05），但与其他年龄组比较，差异无统计学意义（P>0.05）（表1）。

2.4 GBS不同季节的分布情况

根据季节分布情况，第1～4季GBS阳性检出率依次为13.41%、11.30%、14.73%、14.66%。四个季度间GBS阳性检出率差异无统计学意义（P>0.05）（表2）。

3讨论

Realtime PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。细菌培养法是目前检测GBS感染的金标准，但需要培养时间长，易受其他细菌影响导致假阴性，条件要求高，检测率低[3]。应用realtimePCR技术检测GBS与细菌培养法比较，具有几个优点。①快速：可在2～4 h得出结果，并且可检测到死亡的GBS[4]。②灵敏性和特异性高：国内外研究表明，RealtimePCR技术检测GBS的检出率高，灵敏性可达95%～100%，特異性可达94.9%～99.6%[5-8]。③自动化程度高，通量大：从标本DNA提取、PCR扩增及结果分析均可通过相应的仪器和软件来完成，易于标准化。一次可检测96个样本，通量大。

近年来，国内研究发现GBS在围生期感染中是第1位的致病菌[9-10]，不仅导致孕妇胎膜早破，早产等不良妊娠结局，还可通过垂直传播给胎儿，引起胎儿窘迫、新生儿黄疸等不良结局。美国自上世纪90年代开始由CDC出版围生期GBS的防治指南并持续改进，产前GBS的筛查大大降低了新生儿GBS感染性疾病的发生率[11]。而在不同国家、地区的妊娠妇女带菌率有一定的差异，可能与职业、种族、检测方法有关[12]。本研究结果显示，10 691例晚期妊娠妇女感染GBS1466例，阳性率为13.71%。数据比长沙地区7.4%[13]，延边地区的3.44%[14]和中山市的6.70%[15]都高，比惠州市的32.4%[16]、陈明发等[17]报道的19.51%低，与陈海迎等[18-20]报道的14.09%、13.57%[19]相近。单采集阴道分泌物的3889例，检出GBS共有357例，阳性率为9.18%;双采集阴道-直肠分泌物的6802例，检出GBS共有1109例，阳性率为16.30%。双采集阴道-直肠分泌物的阳性率明显高于单采集阴道分泌物，差异有统计学意义（P<0.05），提示围生期孕妇GBS筛查时应同时采集阴道和直肠分泌物联合检测，能明显提高GBS的检出率[2]。本研究中>30～34岁组孕妇GBS阳性率最高（15.32%），与≤20岁组比较，差异有统计学意义（P<0.05），与季修庆等[20]报道的相似。从四季GBS检出情况可看出，秋、冬季的阳性率比春、夏季高，但四季间的差异无统计学意义（P>0.05）。

综上所述，应用Realtime PCR方法对围生期孕妇进行GBS筛查时，同时采集阴道和直肠分泌物联合检测，能明显提高GBS的检出率。GBS在妊娠晚期孕妇中的感染率较高，尤其是年龄>30～34岁组阳性率最高。应加强对孕晚期孕妇的GBS筛检，阳性者及时采取干预措施，降低新生儿GBS感染，改善母婴结局。

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（收稿日期：2019-03-18  本文编辑：崔建中）