硫化氢替代硫磺熏蒸对白芍中二氧化硫残留量及化学成分的影响

张国跃　王莉芳　刘越　乔蓉霞　王梦琪

[摘要]目的 建立用硫化氫熏蒸白芍的操作方法和检测方法。方法 分别用硫磺、硫化氢熏蒸白芍药材和饮片，采用高效液相色谱法测定用不同熏蒸方法后白芍中的芍药苷、芍药苷亚硫酸酯、没食子酸的含量变化。结果 芍药苷进样量为0.055 08～1.652 40 mg、没食子酸进样量为0.011 52～0.345 60 mg，与峰面积呈良好的线性关系，回归方程分别为y=1E+06x-201 93，r=0.999和y=1E+06x+975.7，r=0.999，回收率分别为99.73%和97.85%。用硫化氢熏蒸后，白芍药材中主要成分未发生明显变化，硫磺熏蒸后的白芍饮片，芍药苷含量都有不同程度的下降，同时出现了白芍中原本没有的芍药苷亚硫酸酯，硫化氢熏蒸后的白芍饮片，芍药苷和没食子酸含量与熏蒸前比较，变化不大;熏蒸前24个批次样品二氧化硫残留量的均值为47.7 mg/kg，采用硫化氢熏蒸后的二氧化硫残留量均值为50.4 mg/kg，变化不大，采用硫磺熏蒸后的二氧化硫残留量均值为225.0 mg/kg，变化明显。结论 用硫化氢替代硫磺熏蒸白芍效果较好，方法基本可行，含量测定方法简便，结果准确，重现性较好。

[关键词]硫化氢;硫磺;熏蒸;芍药苷;没食子酸;芍药苷亚硫酸酯;高效液相色谱法

[中图分类号] R284          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-4721（2019）10（c）-0015-05

[Abstract] Objective To establish the operation method and detection method of fumigating Radix Paeoniae Rubra with hydrogen sulfide. Methods The contents of paeoniflorin， paeoniflorin sulfite and gallic acid in Radix Paeoniae Rubra after fumigation with sulfur and hydrogen sulfide were determined by high performance liquid chromatography. Results The injection amount of paeoniflorin was 0.055 08-1.652 40 mg， and the injection amount of gallic acid was 0.011 52-0.345 60 mg， showed a good linear relationship with the peak area， the regression equations were y=1E+06x-201 93， r=0.999 and y=1E+06x+975.7， r=0.999， respectively， the recovery rates were 99.73% and 97.85%. After fumigation with hydrogen sulfide， the main components of Radix Paeoniae Rubra did not change significantly， after sulfur fumigation， the content of paeoniflorin in decoction pieces of Radix Paeoniae Rubra decreased in varying degrees， at the same time， there was paeoniflorin sulfite in Paeonia lactiflora， which was not originally found in Radix Paeoniae Rubra. Compared with the content of paeoniflorin and gallic acid before fumigation， the content of paeoniflorin and gallic acid in the pieces of paeony after fumigation with hydrogen sulfide had little change. The average sulfur dioxide residue of 24 batches of samples before fumigation was 47.7 mg/kg， and the average sulfur dioxide residue after fumigation with hydrogen sulfide was 50.4 mg/kg， with little change. The average sulfur dioxide residue after fumigation with sulfur was 225.0 mg/kg， with obvious change. Conclusion The effect of fumigating Paeonia lactiflora with hydrogen sulfide instead of sulfur is better. The method is basically feasible. The content determination method is simple， the result is accurate and the reproducibility is good.

[Key words] Hydrogen sulfide; Sulfur; Fumigation; Paeoniflorin; Gallic acid; Paeoniflorin sulfite; High performance liquid chromatography

中药材用硫磺来熏制自古有之，硫磺熏蒸药材具有漂白、干燥、杀菌、防霉、杀虫的作用，但过度及滥用硫磺熏蒸，会引起中药材亚硫酸盐的残留，还会导致药效成分发生改变，给药材的安全性和有效性带来较大的风险及隐患。本研究首次提出将硫化氢运用于中药材熏蒸，选择常用硫磺熏蒸且已导致不良后果的白芍为研究对象[1-2]，比较不同熏蒸方法对白芍化学成分、硫元素残留的影响，研究结果显示，用硫化氢熏蒸后的白芍，二氧化硫的残留量和芍药苷、没食子酸等活性成分均无明显变化，同样能起到漂白、干燥、防霉、杀虫的作用，可为白芍的前期处理提供一种安全有效的方法。

1材料与方法

1.1试验仪器

岛津LG-2040-3D型高效液相色谱仪（二极管阵列检测器，日本岛津公司）、Agilent 1260型高效液相色谱仪（紫外检测器，美国安捷伦公司），Waters empower工作站（美国Waters公司）;色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料（Agilent公司，5 μm，4.6 mm×250 mm）、（phenomenex公司，5 μm，4.6 mm×250 mm）;SartoriusBS224S电子分析天平（德国赛多利斯公司）;STEHDB-107-1智能一体化二氧化硫残留量测定仪（济南盛泰电子科技有限公司）;UPH-11-10T型超纯水器（四川超纯科技有限公司）。

1.2试样与试剂

1.2.1试样  白芍药材均自购，标注产地分别是山东、黑龙江、山西、安徽、浙江、江蘇、河南共10批（自编号：药材1～10）;白芍饮片来源于省级监督抽验，共有14个批次，生产企业分别来自陕西的西安、咸阳、宝鸡、商洛和安徽亳州、湖北十堰以及河北的中药饮片生产企业（自编号：饮片1～14）。

1.2.2对照物质和试剂  芍药苷（批号：110736-201842）、没食子酸（批号：110831-200302）对照品均由中国食品药品检定研究院提供;芍药苷硫酸亚酯由本实验室制备。盐酸（国药集团化学试剂有限公司，批号：20180104）、硫化亚铁（国药集团化学试剂有限公司，批号：201701019）均为分析纯，升华硫（上海国药集团，批号：20160101）为化学纯。甲醇（SIGMA-ALDRICH公司，批号：WXBC9153V）、乙腈（SIGMA-ALDRICH公司，批号：WXBC82165V）均为色谱纯，试验用水为纯化水和超纯水。

1.3方法

在实验室条件下，分别用硫磺、硫化氢熏蒸白芍饮片（硫化氢为本实验室自制），考察两种药剂熏蒸前后性状、精密度与稳定性、线性、重复性、回收率、化学成分的变化及二氧化硫残留量的变化。

1.3.1色谱条件与系统适用性试验  Agilent色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），流动相A为乙腈，流动相B为0.1%磷酸溶液;柱温30℃，测定波长230 nm，流速1.0 ml/min，梯度洗脱：时间0→10→25→40→50→60 min，流动相A：2%→8%→15%→17%→20%→45%。

1.3.2对照品溶液的配制  精密称取芍药苷、没食子酸、芍药苷亚硫酸酯对照品适量，分别加甲醇制成含芍药苷约50 μg/ml、没食子酸和芍药苷亚硫酸酯各10 μg/ml的溶液。

1.3.3样品溶液的制备  分别取硫磺、硫化氢熏蒸前后的白芍饮片样品粉末约0.1 g，精密称取，加50%甲醇25 ml，称取重量，超声处理（功率500 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称取重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过即得。

1.3.4精密度与稳定性考察  取上述对照品溶液，分别进样10 μl，重复测定6次。

1.3.5线性考察  取芍药苷对照品溶液（浓度为55.08 μg/ml）、没食子酸对照品溶液（浓度为11.52 μg/ml），按上述1.3.1的色谱条件，分别进样1、2、5、10、20、30 μl，以进样量（x）作为横坐标，以峰面积积分值（y）作为纵坐标进行线性回归。

1.3.6重复性考察  取6份同一样品（饮片1），照上述1.3.3的方法制备试样，然后测定。

1.3.7回收率考察  精密称取样品粉末（饮片1，芍药苷含量为3.01%、没食子酸含量为0.32%）各0.05 g共6份，精密加入含有芍药苷和没食子酸对照品的混合溶液（浓度分别为1.50 mg/L和0.16 mg/L）1 ml，挥干，按照上述1.3.3的方法制备供试样，测定芍药苷和没食子酸的回收率。

1.3.8硫磺、硫化氢熏蒸前后白芍化学成分的变化  根据1.3.1的色谱条件，采用高效液相色谱（HPLC）法检测。

1.3.9硫磺、硫化氢熏蒸后二氧化硫残留量的变化  按照《中国药典》（2015年版四部通则2331第一法）收载的方法[3]，对收集到的白芍药材及饮片逐批测定二氧化硫残留量，首先取样品5～10 g，精密称取，置圆底烧瓶中，采用蒸馏仪器装置蒸馏，收集馏出液，用氢氧化钠滴定液滴定，规定二氧化硫残留量≤400 mg/kg。

2结果

2.1熏蒸前后性状变化

未熏蒸的样品呈微粉红色，表面略具粉性，味微酸，用硫磺熏蒸后，样品表面逐渐变白，熏制10 h以上时，有明显的酸腐气味，较刺鼻，用硫化氢熏蒸后，样品也逐渐变白，熏蒸10 h后，略有酸味，二者有明显差异。

2.2硫磺、硫化氢熏蒸后精密度与稳定性考察

芍药苷、没食子酸对照品峰面积的相对标准偏差（RSD）分别为0.96%和1.44%;取制得的样品溶液分别在0、2、4、6、12、23 h测定，峰面积的RSD分别为1.12%和1.66%。

2.3线性关系考察

回归方程分别为y=1E+06x-201 93，r=0.999和y=1E+06x+975.7，r=0.999，芍药苷进样量在0.055 08～1.652 40 mg，没食子酸进样量在0.011 52～0.345 60 mg，与峰面积呈良好的线性关系（图1）。

2.4重复性考察

芍药苷的平均含量为3.01%，RSD=0.92%;没食子酸的平均含量为0.32%，RSD=1.43%，重复性良好。

2.5回收率考察

芍药苷的平均回收率为99.73%，RDS=0.59;没食子酸的平均回收率为97.85%，RSD=1.95%（表1、2）。

2.6硫磺、硫化氢熏蒸前后白芍化学成分的变化

硫磺熏蒸后的白芍饮片，芍药苷含量都有不同程度的下降，同时出现了白芍中原本没有的芍药苷亚硫酸酯，硫化氢熏蒸后的白芍饮片，芍药苷和没食子酸含量与熏蒸前比较，变化不大（表3、图2）。

2.7白芍药材和饮片二氧化硫残留量的测定

熏蒸前24个批次样品二氧化硫残留量的均值为47.7 mg/kg，采用硫化氢熏蒸后的二氧化硫残留量均值为50.4 mg/kg，变化不大;采用硫磺熏蒸后的二氧化硫残留量均值为225.0 mg/kg，变化明显（表4）。

3讨论

硫磺熏蒸药材可杀虫防霉，为传统的药材养护方法，也曾在《中国药典》[3]中收载过。由于逐渐认识到硫磺熏蒸药材后残留二氧化硫，《中国药典》（2005年版）以后取消了所有药材的硫熏工艺，但在实际应用中，硫磺熏蒸从来就没有真正停止过[4-8]。中药材经过硫磺熏蒸后，会生成二氧化硫，二氧化硫作为一种还原劑，与中药材中的某些化学成分发生化学反应，使中药材中的主要有效成分含量下降，同时会使某些化学成分增加或有新物质生成。研究显示[9-10]，白芍中的芍药苷含量在硫磺熏蒸后明显下降，同时产生了药材中原本没有的化学成分芍药苷亚硫酸酯，本研究结果也证实了这一点。资料显示[11-17]，白芍为常用的药材，硫磺熏蒸对其外观性状、活性成分甚至含有白芍药味中药制剂的影响多有研究，总体上看，负面情况较多。

本研究结果显示，硫磺熏蒸后的白芍饮片，芍药苷含量都有不同程度的下降，同时出现了白芍中原本没有的芍药苷亚硫酸酯，该衍生物的安全性尚不得知;硫化氢熏蒸后的白芍饮片，芍药苷和没食子酸含量与熏蒸前比较，变化不大。

本研究采用硫化亚铁和稀盐酸反应来制备硫化氢，反应原理为FeS+2HCl=FeCl2+H2S↑，将收集到的硫化氢气体导入装有样品的密闭容器中，放置一定时间后，进行测定。此方法只适合在实验室条件下进行，若要应用于大量的药材处理时，需进一步研究熏蒸操作方法。

本研究采用硫磺熏蒸药材及饮片时，尽量采用药农的熏蒸方式，但因实验室条件的限制，熏蒸的效果会和药农熏蒸有差异，主要是熏蒸强度很难达到，因此与日常监督检验检测到的熏蒸药材中二氧化硫残留量比较，数值较低。同时采用不同的熏蒸时间作比较，用硫磺熏蒸白芍时，熏蒸时间越长，二氧化硫残留量越高，芍药苷的含量越低，芍药苷亚硫酸酯的含量从无到有逐渐增加，与文献报导相符合[18-19]，改用硫化氢熏蒸后，延长熏蒸时间，二氧化硫残留量基本上没有变化。

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（收稿日期：2019-05-24  本文编辑：刘克明）