miR-9靶向FOXP1对弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞的作用及机制研究

闻淑娟　张珍连　李姗　胡欣　朱琳　阿孜古丽·麦合麦提　杨顺娥

[摘要]目的 探讨FOXP1上游靶标miR-9对弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）细胞的作用及机制。方法 Targetscan分析miR-9与FOXP1的结合，miR-9与FOXP1结合通过荧光素酶基因报告实验验证;以转染mimic Con为对照组，转染mimic miR-9过表达miR-9后，Western blot检测FOXP1表达变化;实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测人DLBCL细胞OCI-Ly3和人B淋巴母细胞IM9中miR-9的表达水平;过表达miR-9后，体外检测OCI-Ly3的增殖以及侵袭能力的变化。结果 转染miR-9后，mimic miR-9+FOXP1 3′UTR WT组的荧光素酶活性低于转染mimic Con+FOXP1 3′UTR WT组，差异有统计学意义（P<0.0001）;过表达miR-9后，mimic miR-9组的FOXP1表达水平低于mimic Con组，差异有统计学意义（P<0.05）;miR-9在人DLBCL细胞系OCI-Ly3细胞中的表达水平低于B淋巴母细胞，差异有统计学意义（P<0.05）;过表达miR-9后，OCI-Ly3细胞的增殖和侵袭能力低于mimic Con组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 miR-9下调通过靶向FOXP1促进弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞的增殖和侵袭。

[关键词]弥漫性大B细胞淋巴瘤;miRNA;miR-9;FOXP1

[中图分类号] R733.7          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-4721（2019）10（c）-0007-05

[Abstract] Objective To investigate the effect and mechanism of FOXP1 upstream target miR-9 on diffuse large B-cell lymphoma （DLBCL） cells. Methods Targetscan was used to analyze the binding of miR-9 to FOXP1， the luciferase gene reporter assay confirmed the binding of miR-9 to FOXP1. Transfection mimic Con was used as the control group， after transfection of mimic miR-9 after overexpression of miR-9， FOXP1 expression was detected by Western blot. The real-time fluorogenic quantitative PCR （RT-PCR） was used to detect the expression level of miR-9 in human DLBCL cells OCI-Ly3 and B lymphoblastic cell IM9. After overexpression of miR-9， the proliferation and invasion ability of OCI-Ly3 were detected in vitro. Results After transfection with miR-9， the luciferase activity of the mimic miR-9+FOXP1 3′UTR WT group was lower than that in the mimic Con+FOXP1 3′UTR WT group， the difference was statistically significant （P<0.0001）. After overexpression of miR-9， the FOXP1 expression level of mimic miR-9 group was lower than that in the mimic Con group， the difference was statistically significant （P<0.05）. The expression level of miR-9 in human DLBCL cell line OCI-Ly3 was lower than that of B lymphocyte， the difference was statistically significant （P<0.05）. After overexpression of miR-9， OCI-Ly3 cells had lower proliferation and invasion ability than those in the mimic Con group， the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion Down-regulation of miR-9 promotes proliferation and invasion of diffuse large B-cell lymphoma cells by targeting FOXP1.

[Key words] Diffuse large B-cell lymphoma; miRNA; miR-9; FOXP1

彌漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）占非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin′s lymphoma，NHLs）的30%～40%，是常见的淋巴系统恶性肿瘤之一[1]。所有年龄组中都检测得到DLBCL，包括儿科患者，然而，随着患者年龄的增长，DLBCL 发病率也增加，70岁以上患者最常见。男性DLBCL的发病率相对高于女性[2-3]。DLBCLs的生物学特性、基因突变和免疫表型多种多样，直到现在，DLBCL的发病机制仍然很不清楚[4]。

miRNA是具有单链的非编码RNA分子[5]。miRNA可以促进其靶向的mRNA降解，干扰翻译过程发挥基因表达的调控作用[6]。miRNA在几乎所有细胞过程中都具有重要作用，它们在细胞增殖分化等许多细胞过程发挥作用[7]。近年来，研究发现miRNA已成为癌症进展中的重要参与者。miRNA可以抑制或促进肿瘤的发生发展[8]。例如，过表达的miR-142-5p可以抑制胰腺癌的生长[9];miR-187靶向MAPK12抑制骨肉瘤的生长;免疫反应中，miR-424通过T细胞调节上皮性卵巢癌的化疗耐药性[10]。miR-9的表达与细胞分化、增殖、迁移和转移紧密相关。在多种癌症中观察到miR-9的异常表达[11]，表明miR-9参与癌症的发生。然而，目前有关miR-9在DLBCL中的作用尚不确定。

本研究通过miRNA靶基因预测软件Targetscan数据库预测FOXP1上游靶标分子miR-9，检测DLBCL细胞OCI-Ly3中miR-9的表达水平，并测试miR-9对OCI-Ly3增殖和侵袭能力的影响，探究miR-9对弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞的作用及机制，现报道如下。

1材料与方法

1.1材料

DLBCL细胞系OCI-Ly3（上海拜力生物有限科技公司）;人B淋巴母细胞系IM9（武汉尚码生物科技有限公司）;RPMI1640（sigma）;FBS（杭州四季青）;miR-9及U6特异性引物（广州锐博生物科技有限公司）;mimic miR-9（广州锐博生物科技有限公司）;FOXP1抗体（proteintech）;PCR试剂盒（Vazyme Biotech）。

1.2方法

1.2.1细胞培养  DLBCL细胞系OCI-Ly3和人B淋巴母细胞系IM9在37℃细胞恒温箱中孵育，RPMI1640补充有10%（V/V）的FBS、青霉素（100 U/ml）和链霉素（100 U/ml）。

1.2.2实时荧光定量  实时荧光定量PCR（RT-PCR）TRIzol法提取总RNA。使用PCR试剂盒逆转录miR-9。之后，使用RT-PCR检测成熟miR-9的表达，使用U6特异性引物作为内参。

1.2.3荧光素酶基因报告实验  根据Targetscan软件预测miR-9与FOXP1 mRNA 3′-UTR区结合序列。将含该结合位点的片段插入到荧光素酶报告基因质粒。构建两组质粒：包含该结合位点的野生型质粒（FOXP1 3′UTR WT）以及突变该结合位点的突变质粒（FOXP1 3′UTR Mut）。转染OCL-LY-3细胞miR-9 mimic和两组质粒，摩尔比为50∶1。miRNA对照用作阴性对照。24 h后根据说明书（Promega，E2920），测定荧光素酶活性。

1.2.4 miR-9转染  将OCI-Ly3细胞系铺板，根据锐博生物科技公司提供的说明书，使用lipofectamine 2000进行转染，mimic miR-9用于过表达miR-9，对照组转染mimic Con。24～48 h后进行后续实验。

1.2.5细胞增殖检测  对转染miR-9 mimic的OCI-Ly3细胞进行细胞增殖检测，检测起点记为0 h，分别在0、6、12、24 h收集细胞，实验血球计数板进行细胞计数。

1.2.6细胞侵袭能力检测  使用Transwell进行体外细胞侵袭实验。简而言之，Transwell小室PVDF膜上用基质胶与处理，细胞恒温箱中平衡2 h。PBS清洗1遍，在Transwell内室加入细胞悬液（1×105细胞/孔），恒温箱中孵育24 h。轻轻擦去靠近内侧细胞，另用甲醛室温固定30 min，结晶紫染色20 min，PBS洗3遍，显微镜下进行细胞计数。每组设三复孔。

1.2.7 Western blot分析  RIPA裂解液裂解细胞，在冰上提取总蛋白;于4℃条件下，12 000 g离心20 min;BCA蛋白定量;12%十二烷硫酸钠-聚丙烯酰胺凝膠电泳分离蛋白，湿转法制得PVDF膜;用TBST洗涤PVDF膜3次，每次15 min;5%脱脂牛奶室温封闭2 h;加入一抗（FOXP1，1∶1000），4℃过夜;用TBST洗涤3次，每次15 min;室温孵育二抗（辣根过氧化物酶标记的羊抗兔或羊抗鼠IgG二抗，1∶2000）2 h;用TBST洗涤3次，每次15 min;用化学发光显色法显影，拍照统计。

1.3实验分组

分组包括如下：①荧光素基因报告实验分组，包括mimic Con+FOXP1 3′UTR WT组、mimic miR-9+FOXP1 3′UTR WT组、mimic Con+FOXP1 3′UTR Mut组及mimic miR-9+FOXP1 3′UTR Mut组。②miR-9对FOXP1表达调控作用验证分组，包括mimic Con组及mimic miR-9组。③miR-9在人DLBCL细胞OCI-Ly3和人B淋巴母细胞IM9中表达水平验证分组，包括B淋巴母细胞组及人DLBCL组。④miR-9对OCI-Ly3细胞体外增殖以及侵袭能力的作用验证：mimic Con组，mimic miR-9组。

1.4观察指标

本研究观察指标包括：①比较mimic Con+FOXP1 3′UTR WT组与mimic miR-9+FOXP1 3′UTR WT组的荧光素酶活性，荧光素酶活性降低降低，表明miR-9与FOXP1结合;②比较mimic Con组与mimic miR-9组的FOXP1表达水平，FOXP1表达水平降低，表明miR-9抑制FOXP1表达;③比较人DLBCL细胞OCI-Ly3和人B淋巴母细胞IM9中miR-9的表达水平;④比较mimic Con组与mimic miR-9组OCI-Ly3细胞增殖数目以及穿过Transwell的细胞数目，细胞计数降低，表明miR-9抑制OCI-ly3细胞体外增殖和侵袭。

1.5统计学方法

采用SPSS 11.5统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 miR-9与FOXP1结合

利用miRNA靶基因预测软件Targetscan预测出miR-9与FOXP1直接结合，预测结果见图1，封三。并采用荧光素酶实验验证miR-9与FOXP1的结合，结果提示，mimic miR-9+FOXP1 3′UTR WT组的荧光素酶活性低于转染mimic Con+FOXP1 3′UTR WT组，差异有统计学意义（P<0.0001），mimic Con+FOXP1 3′UTR Mut组与mimic miR-9+FOXP1 3′UTR Mut组的荧光素酶活性比较，差异无统计学意义（P>0.05）（图2）。

2.2过表达miR-9对FOXP1表达的影响

过表达miR-9对FOXP1表达的影响，结果见图3，结果提示，过表达miR-9抑制FOXP1表达。在DLBCL细胞系OCI-Ly3细胞中使用mimic miR-9过表达miR-9，mimic miR-9组的FOXP1表达水平低于mimic Con组，差异有统计学意义（P<0.05）（图4）。

2.3 miR-9在DLBCL细胞系和B淋巴母细胞中的表达情况

结果提示，人DLBCL细胞系OCI-Ly3细胞的miR-9表达水平低于B淋巴母细胞，差异有统计学意义（P<0.05）（图5）。

2.4过表达miR-9对OCI-Ly3细胞增殖的影响

在OCI-Ly3细胞中转染miR-9 mimic后进行细胞增殖检测，结果提示，在转染后12、24、48 h后，mimic miR-9组的细胞数目少于mimic Con组，差异有统计学意义（P<0.05）（图6）。

2.5过表达miR-9对OCI-Ly3细胞体外侵袭能力的影响

在OCI-Ly3细胞中转染miR-9 mimic后进行Transwell体外细胞侵袭实验，mimic Con组穿过Transwell的细胞数为（879±24）个，mimic miR-9组穿过Transwell的数目为（487±28）个。mimic miR-9组穿过Transwell的数目少于mimic Con组，差异有统计学意义（t=26.635，P<0.001）。

3讨论

FOXP1在许多生物过程中起着重要作用，包括T细胞和B细胞的发育和功能[12-15]。此外，FOXP1已被确认为是肝细胞癌、胰腺癌和各种类型的B细胞非霍奇金淋巴瘤的潜在致癌基因[16-18]。研究发现， DLBCL和粘膜相关淋巴组织（MALT）淋巴瘤中，FOXP1的高表达与肿瘤预后不良相关联，并且促使其转变为侵袭性淋巴瘤[19-20]。长期以来，FOXP1被认为是DLBCL中推定的致癌基因，其通过促进B细胞存活，抑制浆细胞分化，增强Wnt信号传导和抑制主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）Ⅱ类分子表达等机制发挥致癌作用[21-23]。

miRNA在转录后水平介导mRNA降解从而调控基因表达。本研究通过Targetscan数据库分析发现，miR-9可以与FOXP1的3′UTR区结合。通过荧光素酶实验证实miR-9与FOXP1的结合。过表达miR-9则导致FOXP1的表达水平降低，进一步证实miR-9作为FOXP1的上游靶标分子，调控FOXP1的表达。而FOXP1已经在DLBCL中进行了广泛的研究，已知它可以调节B细胞的存活和侵袭性，高FOXP1水平的DLBCL预后更差。因此其上游靶标分子miR-9在DLBCL中可能发挥重要作用。RT-PCR结果显示，在DLBCL细胞系中miR-9的表达低于人淋巴母细胞IM9。鉴于miR-9与FOXP1的3′-UTR區的结合及其对FOXP1的调节作用，miR-9的异常表达可能是导致FOXP1在DLBCL中高表达的机制之一。在DLBCL细胞系OCI-Ly3中过表达miR-9，可以抑制OCL-Ly3细胞的增殖和侵袭能力。表明miR-9可以靶向FOXP1调节DLBCL细胞的增殖和侵袭能力。miR-9的表达失调可能是促进DLBCL发展的机制之一。

综上所述，miR-9通过靶向FOXP1在DLBCL中起关键作用。MiR-9表达失调可通过上调其下游靶标分子FOXP1表达促进DLBCL细胞增殖和转移。本研究有助于了解miR-9在DLBCL中的作用及机制，然而，miR-9是否也通其他分子靶标调节DLBCL发生发展过程，仍有待进一步的研究。

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（收稿日期：2019-07-04  本文編辑：孟庆卿）