血清miR-26a/b 对原发性胃癌的诊断效果研究

李延领

(济源市人民医院消化科，河南 济源 454600)

随着社会节奏加快以及生活方式的转变，胃癌已经成为影响全人类生命与生活质量不容忽视的疾病,有研究报道目前胃癌发病率已经居世界肿瘤疾病第4位，死亡率居第2位[1]。胃癌不仅发病率高，恶性程度也相当高，患者的生命质量受到极其严重的威胁,尤其是中晚期胃癌患者往往因为病情恶化丧失了治疗的机会。因此提高胃癌患者的生命质量,提高胃癌的诊断率具有重要的临床意义[2]。目前胃镜检查联合粘膜活检是较为常用的胃癌诊断方式,而以分子标志物进行检查是近年来广泛应用且诊断率较高的检查方式,对于胃癌的诊断主要依赖于CEA、CA19-9、CA72-4等分子标志物，但以上标志物往往在中期或晚期胃癌中具有较好的诊断价值，在早期胃癌的诊断中作用尚不明显，因此为提高胃癌的早期诊断率研究新的标志物具有重要意义[3-4]。微小RNA（miRNA）是广泛存在于真核生物中的小型非编码RNA,是一类能够影响基因表达的调节分子。目前临床发现miRNA与包括乳腺癌、肺癌、前列腺癌、肝癌以及胃癌等多种恶性肿瘤疾病的发病有一定的相关性,其对靶基因表达的调节作用能够影响癌细胞的增殖分化、迁移侵袭等多个方面[5-6]。为提高原发性胃癌早期诊断率,现以血清miR-26a与miR-26b为诊断标志物,探究此两种标志物在原发性胃癌患者中的表达情况,从而进一步探究其对原发性胃癌的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年5月至2018年1月于我院接受治疗的102例原发性胃癌患者、39例入院治疗的非肿瘤性胃病患者以及同期入院体检的89例健康个体为研究对象，其中：

观察组：102例胃癌患者为观察组，患者年龄39~58岁,平均年龄44.68±7.72岁,其中男性患者67例,女性患者35例。

疾病对照组：39例非肿瘤性胃病患者为疾病对照组，患者年龄32~69岁,平均年龄44.29±8.04岁,其中男性患者20例,女性患者19例。

对照组：89例健康个体为对照组,个体年龄34-62岁，平均年龄45.43±8.86岁，其中男性个体61例，女性个体28例。

各组患者年龄及性别比较差异无统计学意义P>0.05。所有患者均符合以下纳入标准：⑴符合原发性胃癌的临床诊断标准[7]⑵除胃癌外无其他肿瘤疾病⑶无糖尿病、高血压等内科疾病⑷预计生存期≥3个月⑸患者及家属均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 血样采集 提前一天通知所有患者第二天进行血样采集,患者空腹条件下抽取静脉血5ml,低温保存于促凝管中。待所有血样收集完毕后以3000r/min离心15min,取离心后上层清液于不含RNA酶的1.5ml离心管中。血清置于-80℃环境下保存。

1.2.2 胃癌组织采集 收集胃癌患者手术切除的胃癌组织以及距离肿瘤边缘5cm以上的正常组织,共取标本102对。手术切除获得的新鲜胃癌组织标本置于液氮中冷冻保存。

1.2.3 mi-RNA提取与qRT-PCR检测 根据TRI-zol操作标准提取血清样本中的mi-RNA,使用紫外分光光度计对RNA质量与浓度进行测定。提取2μLRNA进行逆转录操作，根据逆转录酶及其产品说明书，在 16℃15min、42℃1h、85℃5min的条件下进行逆转录操作,操作完毕获取的cDNA置于-20℃环境下保存。qRT-PCR检测使用探针法，在95℃5min、95℃15s、60℃1min 的反应条件下进行操作，最后两步反应条件共40个循环。以管家基因U6snRNA表达量为内参值,以荧光信号达到设定阈值时PCR经历的循环数为Ct值。

1.3 评价指标 比较两组患者血清中miR-26a与miR-26b的表达量；比较观察组患者不同胃癌病理特征的miR-26a与miR-26b的表达量；使用logistics多因素回归分析血清miR-26a与miR-26b的表达量与原发性胃癌之间的相关性。

1.4 统计学方法 采用SPSS19.0软件对研究中得到数据进行统计学分析。计量资料的两组比较采用t检验，多组比较为方差分析。计数资料比较用χ2检验。有统计学意义的相关因素行多因素Logistic回归分析。诊断价值评价行ROC分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者miR-26a与miR-26b表达量比较整体比较知：各指标整体差异有统计学意义 （P＜0.05）。多重比较并结合主要数据分析：观察组患者血清miR-26a表达量为 1.60±1.02、miR-26b表达量为1.40±0.68,低于疾病对照组与对照组,差异均具有统计学意义P<0.05。见表1。

表1 两组患者miR-26a与miR-26b表达量比较

2.2 观察组不同病理特征患者miR-26a与miR-26b表达量比较 观察组不同胃癌病理特征患者的miR-26a与miR-26b的表达量比较发现,有淋巴结转移的患者miR-26a与miR-26b表达量低于无淋巴结转移的患者，差异具有统计学意义(P<0.05)。病理分期Ⅳ期患者miR-26a与miR-26b表达量低于Ⅲ期、Ⅱ期以及Ⅰ期患者，且病理分期越高miR-26a与miR-26b表达量越低，差异具有统计学意义(P<0.05)。 见表 2。

2.3 logistics多因素回归分析 以本研究观察组和疾病对照组资料为样本。是否原发性胃癌为应变量，赋值1=是（观察组），0=否（疾病对照组）。以miR-26a与miR-26b表达量为自变量,并分别按该二表达量的两组总均值（取整后分别为2.6和2.4）进行两分类转化，赋值1≤总均值，0≥总均值。建立非条件logistics多因素回归模型。分析显示：miR-26a与miR-26b表达量与原发性胃癌发病之间有明显的关联性，miR-26a表达量与原发性胃癌发病的OR值为1.442、P值为 0.004，miR-26b表达量与原发性胃癌发病的 OR值为 2.942、P=0.009。见表3。

2.4 miR-26a与miR-26b表达对诊断原发性胃癌的价值分析 采用ROC分析进行了miR-26a与miR-26b表达对原发性胃癌的诊断价值分析。仍以观察组和疾病对照组资料为样本，并适当划分该二指标数据/表达水平为7~8个组段，建立ROC分析模型。结果：该二指标的ROC-AUC均在0.75以上，敏感度和特异性都在0.7附近，提示有较高的原发性胃癌诊断价值。见表4。ROC曲线见图1。

3 讨论

恶性肿瘤疾病的早期诊断是临床人们非常关注的问题,近年来血清肿瘤标志物的广泛应用大大提高了恶心肿瘤的早期检出率,使部分肿瘤患者的生存质量得到极大的提高。但是对于原发性胃癌目前却没有非常有效的检查途径,临床使用较多的CEA、CA72-4、CA19-9在胃癌的检测中特异性并不强，因此如何提高胃癌的早期诊断率逐渐成为临床重点关注的问题[8-9]。近年来miRNAs被发现具有调控细胞凋亡的作用，mRNAs是一类含有21-23个核苷酸的小型内源性非编码RNA，能够在转录后调节基因的表达[10-11]。研究表明miRNA是细胞分化凋亡以及影响信号通路的主要调控因子，且有研究认为其在癌症的诊断中具有一定的价

值，为进一步探究miRNA在肿瘤疾病尤其是胃癌中的作用,现开展血清miR-26a与miR-26b对原发性胃癌的诊断效果研究。

表2 观察组不同病理特征患者miR-26a与miR-26b表达量比较

表3 logistics多因素回归分析结果

表4 ROC分析结果

图1 ROC曲线

研究结果显示,胃癌患者血清miR-26a与miR-26b表达量明显低于正常个体，且两组数据比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。此结果提示miR-26a与miR-26b的表达的确与胃癌发病具有非常密切的关联性,如果临床检测患者miR-26a与miR-26b表达量较低,且出现胃癌相关的临床病症，则有理由认为患者发生胃癌的可能性较高。进一步探究miR-26a与miR-26b与胃癌发病程度的关系,本研究对不同病理特征的胃癌患者胃癌组织额miR-26a与miR-26b进行比较,研究发现出现淋巴结转移的患者miR-26a与miR-26b表达水平明显低于未出现淋巴结转移的患者,这就意味着在已经诊断出胃癌的患者中，miR-26a与miR-26b表达水平越低则患者的病情有可能越严重[12-13]。病理分期结果显示Ⅳ期患者miR-26a与miR-26b表达量远远低于前三期患者,且病理分期越靠后，miR-26a与miR-26b表达量越低,此结果与淋巴结转移结果可一同为诊断患者胃癌进展程度提供依据。

无论是胃癌患者与正常个体比较,还是不同病理特征的胃癌患者组内比较，研究都发现miR-26a与miR-26b与胃癌之间有明显相关性。为进一步理清二者的关系进行回归分析，logistics多因素回归分析显示miR-26a与miR-26b与胃癌发病之间确有相关性,当miR-26a与miR-26b表达较低时提示患者有发生胃癌的风险[14-15]。

本研究进一步做了miR-26a与miR-26b对胃癌发病诊断预测的价值研究。ROC分析发现：该二指标的 ROC-AUC 均在 0.75以上（P＜0.05），敏感度和特异性都在0.7附近，提示有较高的原发性胃癌诊断价值。即如前分析一致：若早期检测miR-26a与miR-26b水平在理论阈值 （分别为2.64和2.41）以下，则胃癌发病的可能性将大大增加。

综上所述,血清miR-26a与miR-26b表达量与原发性胃癌之间有显著相关性,胃癌患者miR-26a与miR-26b表达量处于较低水平,且病理特征表现越严重，miR-26a与miR-26b表达量越低，具有良好的临床诊断价值。