重组脂联素对自然流产模型小鼠妊娠结局及Th17/Treg 平衡的影响

乔小改

（郑州大学第二附属医院产科，河南 郑州 450000）

正常妊娠为一种成功的半同种异体移植现象，其前提是母胎之间正常的免疫耐受，这种耐受过程存在复杂精细的免疫调节，其中有多种诸如辅助性T细胞17(T helper cell17，Th17)和CD4+CD25+调节性 T 细胞（regulatory T cell，Treg）的免疫细胞参与[1,2]。近年来多篇文献报道[3,4]不明原因复发性流产（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)与Th17/Treg失衡密切相关。脂联素（adiponectin，APN）是一类由脂肪细胞分泌的激素蛋白，不仅参与非胰岛素依赖型糖尿病 （non-insulin dependent diabetes，NIDD）、 冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronary atherosclerotic heart disease，CAHD）的发展,也与妊娠糖尿病、妊娠特发性脂肪肝、先兆子痫等妊娠并发症的发生有一定关联。相关研究发现[5]APN受体在试管婴儿反复胚胎种植失败者中呈低表达,提示APN信号缺乏可能导致妊娠失败。Ramezani A等[6]的课题研究发现APN体外处理可改善自然流产者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）的 Th17/Treg失衡。但目前尚未见到APN对自然流产模型小鼠妊娠结局及Th17/Treg失衡影响的相关研究报道,故本研究欲通过观察APN对自然流产模型小鼠妊娠结局及Th17/Treg细胞分群的影响,为自然流产防治措施的研究提供参考,现将研究结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 经动物保护协会及医学伦理委员会批准,选用购于上海南方模式生物科技股份有限公司,许可证号：SCXK（沪）2017-0010的 8~10周龄健康SPF级雄性BALB/c小鼠、雄性DBA/2小鼠、雌性CBA/J小鼠，平均体质量约25g。小鼠分笼饲养于动物实验室独立通气笼中,实验室室温维持在22~25℃，湿度维持在50%~60%，采用同种无菌饲料对所有小鼠进行投喂，不限制饮水，每天光照12h，适应性喂养1周。

1.2 实验试剂 小鼠脂联素、转化生长因子β（Transforming growth factor β，TGF-β）、白细胞介素 17（Interleukin17，IL-17）酶联免疫吸附试剂盒购于美国TSZ;生理盐水购于上海乔羽生物科技有限公司；脂联素重组蛋白购于美国Amresco；PBS缓冲液购于常德比克曼生物科技有限公司；FITC-CD25单克隆抗体购于广州健仑生物科技有限公司；FITC-IL-17A单克隆抗体购于美国eBioscience；布雷菲德菌素A（BFA）购于湖北欣欣佳丽生物科技有限公司；PE-Cy7-CD4单克隆抗体购于上海瑞齐生物科技有限公司；PE-FoxP3单克隆抗体购于上海微蒙生物公司；佛波酯（PMA）购于南京春秋生物工程有限公司；伊诺霉素（ionomycin）购于美国Sigma。

1.3 小鼠模型及给药方式 适应性喂养1周后，将雌性CBA/J小鼠与雄性BALB/c小鼠合笼交配建立正常妊娠（Normal pregnancy，NP）模型（n=10），雌性CBA/J小鼠与雄性DBA/2小鼠合笼交配建立自然流产（spontaneous abortion，SA）模型（n=20），各小鼠合笼后，观察阴栓，若发现阴栓则计为妊娠第0日，将雌性CBA/J小鼠与雄性BALB/c小鼠、雄性DBA/2小鼠隔离饲养。将20只SA模型小鼠采用随机数字列表法分为脂联素组 （APN组，n=10）和生理盐水组（NS 组，n=10），妊娠第 5d，APN组 CBA/J孕鼠腹腔注射 10μg/（kg·d）重组脂联素，1次/d，NP组和NS组CBA/J孕鼠腹腔注射等量生理盐水。3组疗程均为9 d。

1.4 评价指标

⑴脂联素、IL-17、TGF-β 水平：CBA/J孕鼠眼球取血，2 419×g离心10 min，分离血清，采用酶联免疫吸附法 (ELISA)检测CBA/J孕鼠血清中脂联素、IL-17、TGF-β、IL-17/TGF-β 水平。

⑵胚胎吸收率：疗程结束,将CBA/J孕鼠处死，无菌状态下打开腹腔，切开子宫，分离胚胎、胎盘等，将其与正常胚胎作比较，观察胚胎大小、出血情况、吸收情况等，计数存活胚胎数和吸收胚胎数，计算胚胎吸收率。胚胎吸收率=吸收胚胎数/总胚胎数×100%。

⑶脾脏淋巴细胞中Th17、Treg比例：疗程结束,将CBA/J孕鼠处死，无菌状态下打开腹腔，分离CBA/J孕鼠脾脏，充分剪碎，制成匀浆液，用200目不锈钢滤网过滤，分离获得小鼠脾脏淋巴细胞，调整细胞悬液浓度为1×107/ml。取小鼠脾脏淋巴细胞悬液 200μl， 加入 0.05ng/L PGMEA、10 ng/L BFA、1mol/L伊诺霉素37℃孵育5 h，PBS漂洗，加入10μl PE-Cy7-CD4抗体，4℃避光孵育 0.5h，PBS漂洗，再加入10μl FITC-IL-17A抗体，4℃避光孵育0.5h，PBS缓冲液重悬细胞，采用流式细胞仪（美国贝克曼库尔特，型号：CytoFLEX LX）检测CD4+IL-17A+细胞占CD4+T淋巴细胞的比例。同上，取小鼠脾脏淋巴细胞悬液200μl，加入10μl FITCCD25抗体、10μl PE-Cy7-CD4抗体，4℃避光孵育0.5h，PBS漂洗，加入PE-FoxP3抗体，4℃避光孵育0.5h，PBS缓冲液重悬细胞，采用流式细胞仪检测CD4+CD25+FoxP3+细胞占CD4+T淋巴细胞的比例。

1.5 统计学处理 采用spss22.0软件进行统计分析。计量资料多组间比较采用单因素方差分析，其中两两比较采用SNK-q检验；计数资料比较采用卡方检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组孕鼠妊娠结局 与NP组比较，NS组胚胎吸收率明显升高（P<0.05）；与NS组比较，APN组胚胎吸收率明显下降（P<0.05）；NP组、APN组胚胎吸收率相比,差异无统计学意义（P＞0.05）,见表 1。

表1 各组孕鼠胚胎吸收情况比较[n(%)]

2.2 各组孕鼠血清中脂联素、IL-17、TGF-β、IL-17/TGF-β水平 与NP组比较，NS组血清中脂联素、TGF-β 水平明显下降（P<0.05），IL-17、IL-17/TGF-β水平明显升高（P<0.05）；与NS组比较，APN组血清中脂联素、TGF-β水平明显升高（P<0.05），IL-17、IL-17/TGF-β 水平明显下降 （P<0.05）；NP 组、APN 组血清中脂联素、IL-17、TGF-β、IL-17/TGF-β 水平相比，差异无统计学意义（P＞0.05）,见表 2。

2.3 各组孕鼠脾脏淋巴细胞中Th17、Treg细胞分群 与NP组比较，NS组Th17/CD4+T细胞比例、Th17/Treg比值明显升高 （P<0.05），Treg/CD4+T细胞比例明显下降（P<0.05）；与NS组比较，APN组Th17/CD4+T细胞比例、Th17/Treg比值明显下降（P<0.05）,Treg/CD4+T 细胞比例明显升高(P<0.05)；NP组、APN组Th17/CD4+T细胞比例、Th17/Treg比值、Treg/CD4+T细胞比例相比,差异无统计学意义（P＞0.05）,见表 3。

表3 各组孕鼠脾脏淋巴细胞中Th17、Treg细胞分群比较（)

表3 各组孕鼠脾脏淋巴细胞中Th17、Treg细胞分群比较（)

与NP组比较,*P<0.05；与APN组比较,#P<0.05

组别 例数(只)NP组NS组APN组10 10 10 FP Th17/CD4+T细胞Treg/CD4+T细胞1.80±0.75 5.70±1.30*#2.05±0.90 46.687<0.001 6.59±1.51 3.79±0.40*#6.30±1.05 20.078<0.001 Th17/Treg 0.30±0.09 1.51±0.29*#0.33±0.25 92.351<0.001

3 讨论

成功妊娠实际是成功的母胎免疫耐受，这种耐受过程中若出现Th17/Treg失衡，则容易发生复发性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）[3,4]。RSA是指反复的自发性流产，为妊娠期常见并发症，约占妊娠人群的30%。现有的检查手段能明确的病因包括内分泌异常、父母染色体异常（如平衡易位携带者）、母体子宫结构异常、自身免疫异常（如抗磷脂抗体综合征），但仍存在40%RSA人群不能明确病因则定义为URSA。由于URSA病因不明，临床对URSA干预的针对性欠佳，使其成为生殖领域的难点。多位学者[7,8]就URSA的治疗进行研究发现利用第三方的淋巴细胞进行免疫治疗或静脉注射免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）等疗效一般，安全性也有待证实。因此，寻找有效治疗方案对存在免疫耐受失败风险人群有重要意义。

表2 各组孕鼠血清中脂联素、IL-17、TGF-β、IL-17/TGF-β水平比较（)

表2 各组孕鼠血清中脂联素、IL-17、TGF-β、IL-17/TGF-β水平比较（)

与NP组比较,*P<0.05；与APN组比较,#P<0.05

组别 例数(只)NP组NS组APN组10 10 10 FP脂联素（ng/ml）12.79±0.58 3.38±0.19*#11.92±1.05 549.951<0.001 IL-17（pg/ml）33.62±2.49 137.49±11.29*#48.20±6.69 531.726<0.001 TGF-β（pg/ml）72.42±2.09 32.31±5.50*#68.28±7.29 166.348<0.001 IL-17/TGF-β 0.48±0.13 4.27±0.07*#0.69±0.3 1217.560<0.001

白色脂肪组织可分泌抵抗素、瘦素(leptin，LEP)、血管紧张素（Angiotensin）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、APN 等多种蛋白质，APN为脂肪细胞分泌的蛋白质中较为重要的一种[9]，其可参与整个妊娠过程，还能调控炎症反应,并涉及对IG、细胞因子（如细胞刺激因子、白细胞介素、干扰素）、补体、人类白细胞抗原（Human leukocyte antigen,HLA）等免疫分子表达的影响[10]。相关文献报道[11,12]APN还可调节Th17/Treg,在NID D、CAHD等疾病发生、发展过程中扮演重要角色。Zhu L等[13]发现正常妊娠者血清中APN水平明显高于RSA患者,提示APN水平与妊娠结局（如URSA、胎儿早产或出生缺陷）密切相关。Wei-Hong L I等[14]进行体外试验发现APN处理后URSA患者PBMC中Th17比例减少,CD4+CD25+调节性 T细胞比例上升,使Th17/Treg趋于正常,说明APN在妊娠过程中对Th17/Treg平衡有一定影响，而母胎之间正常的免疫耐受往往存在免疫调节,进一步提示APN可能可母胎免疫有关。CBA/J×DBA/2为经典的SA动物模型，孕鼠对胚胎的雄性抗原识别异常，从而产生异常的免疫应答可能为SA发生的主要机制。本研究中，NS组胚胎吸收率与NP组比较明显升高，APN组胚胎吸收率与NS组比较明显下降，结果与Fei W U等[15]人的报道基本相符，提示APN可有效改善SA小鼠胚胎吸收情况，减少不良妊娠结局。Th17、Treg为两类重要的免疫细胞。Th17细胞是一种具有很强的促炎症作用的能够分泌IL-17的T细胞亚群,可参与系统性红斑狼疮(SLE)、自身免疫性溶血性贫血（AHA）、多发性脑脊髓硬化症（MS）等自身免疫性疾病发生、发展，且与不良妊娠结局有密切关系[16]。而Treg是一类重要的具有促进母胎耐受、维持正常妊娠作用的免疫抑制细胞。一直以来，Th17/Treg平衡是生殖免疫耐受领域的研究热点,为了进一步探讨APN对SA作用机制,本研究采用流式细胞术检测重组脂联素对CBA/J孕鼠脾脏淋巴细胞中Th17/Treg分群的影响，结果显示，NS组Th17/CD4+T细胞比例、Th17/Treg比值较NP组明显升高，Treg/CD4+T细胞比例较NP组明显下降；APN组Th17/CD4+T细胞比例、Th17/Treg比值较 NS 组明显下降 （P＜0.05），Treg/CD4+T细胞比例较NS组明显升高。因此，我们推测重组脂联素可能通过调控脾脏淋巴细胞中失衡，影响母体对父系抗原特异性免疫耐受，从而使SA模型小鼠不良妊娠结局得以显著改善。

综上,重组脂联素治疗可能通过纠正Th17/Treg细胞失衡及相关细胞因子水平，改善SA模型小鼠的妊娠结局。但本研究造模数较少，有待扩大样本作进一步研究。