联合检测外周血VEGF 和EMMPRIN mRNA 在肝癌转移监测中的意义

沈学文 ，刘爱 ，邬艳 ，刘静 ，余晓慧

(1.宁波市奉化区中医院消化科，浙江 宁波 315500；2.宁波市奉化区社区卫生服务中心，浙江 宁波315500；3.南昌市东湖区疾病预防控制中心，江西 南昌 330006；4.南昌大学第二附属医院检验科，江西 南昌330006；5.瑞昌市人民医院检验科，江西九江332200)

原发性肝癌恶性程度高，恶化速度快，我国其发病率在各种恶性肿瘤中位居第二。外科手术是目前最有效的肝癌治疗措施,但术后5年复发率却可超过70%，因此肝癌预后极差[1]。国内外研究表明转移和复发是影响肝癌患者生存率的主要因素,这与肝癌的高度血管浸润及转移倾向密切相关[2]。

肝癌转移前期仅有少量癌细胞或癌细胞团存在于外周血液[3]，影像、病理等常规检查方法不能发现，最近研究显示，通过高度敏感、特异的基因检测技术能检测到肝癌早期转移时血液中肿瘤相关基因的mRNA[4,5]，从而为肝癌的转移和复发争得宝贵的治疗先机。

本研究通过检测原发性肝癌患者外周静脉血中游离的血管内皮生长因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）mRNA 和基质金属蛋白酶诱导因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN）mRNA，探索它们在肝癌早期转移监测中的作用。

1 材料与方法

1.1 标本来源

1.1.1 收集本院2016年10月至2018年10月收治的16例经病理方法确诊为原发性肝癌伴转移的患者外周血5ml，以EDTA-2K抗凝，作为肝癌转移组标本。患者年龄36～86岁，中位数年龄68.5岁，其中男11例，女5例；肝内转移14例，肝外转移2例。

1.1.2 收集同期经病理方法确诊为原发性肝癌但无转移的患者16例，抽取外周血5ml，以EDTA-2K抗凝，作为肝癌无转移组标本。患者年龄31～89岁，中位数年龄63岁，其中男10例，女6例。

1.1.3 收集性别、年龄构成相仿的健康体检者外周血16例，每例5ml，以EDTA-2K抗凝，作为健康对照组标本。

1.1.4 三组研究对象在性别、年龄构成等方面差异均无统计学意义。

1.2 方法

1.2.1 标本处理 上述新鲜血液样本置4℃保存，48h内用Ficoll密度离心法分离单个核细胞，分离方法如下：以Hank’s液按1：1的比例稀释全血标本，缓慢滴加到含Ficoll溶液的15ml离心管中，Ficoll和血液体积比为 1：2，400g，4℃离心 30min，用滴管吸取血清和Ficoll交界的单个核细胞层，以Hank’s液洗涤一次后用冻存液置于-80℃冻存。用Trizol试剂抽提细胞总RNA。检测RNA质量后行逆转录合成cDNA。

1.2.2 荧光定量PCR检测 VEGF基因扩增引物为, 上游：5′-GAT CGA GTA CTA CTT CAA GCC-3′, 下游：5′-TTG TTG TGC TGT AGG AGG C-3′；EMMPRIN基因扩增引物为，上游：5′-CCG GTC AGA GCT ACA CAT TGA-3′, 下游：5′-TCT TGC CTT TGT CAT TCT GGT-3′；反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和熔解曲线；以GAPDH表达量为内参照标准，根据双delta法计算各基因的相对表达量。

1.2.3 统计分析 Real Time PCR每次测定均设置3个复孔,结果以均数±标准差表示。数据以SPSS12.0进行分析,统计学分析方法为两样本均数t检验和四格表卡方检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VEGF和EMMPRIN的相对表达情况 与健康对照组相比，VEGF和EMMPRIN在肝癌无转移组和肝癌转移组均显著高表达，VEGF在两组中的相对表达量分别为 2.44±0.47 和 5.78±0.41，EMMPRIN 为 4.21±1.06和 7.34±1.26。在健康对照组、肝癌无转移组和肝癌转移组,组间两两比较,VEGF和EMMPRIN表达量差异均有统计学意义,见图1。

图1 VEGF和EMMPRIN mRNA表达量

2.2 外周血VEGF和EMMPRIN mRNA监测肝癌转移的评价 健康对照组与肝癌无转移组、健康对照组与肝癌转移组、肝癌无转移组与肝癌转移组中VEGF和EMMPRIN mRNA的表达经卡方检验P值均小于0.05，差异均有统计学意义。见表1。

表1 VEGF和EMMPRIN mRNA在各组中的表达情况

3 讨论

肝脏肿瘤中肝细胞癌是典型的富血管的肿瘤,血管生成因子对肿瘤的生长和转移有重要的调控作用，尤其是VEGF基因[6]。VEGF是一种选择性血管内皮细胞有丝分裂原,是目前已知的最直接的血管生成活性蛋白,多数研究认为其表达水平增高可以促进肿瘤血管的增生,使肿瘤微血管密度增加，有利于肿瘤细胞的生长和转移[7-8]。我们的研究显示，在外周血中，与健康对照组相比，VEGF在肝癌组和转移组均显著高表达,并且转移组的表达量还明显高于无转移组,这说明肝癌患者外周血中的VEGF水平可能对肝癌转移具有一定的提示作用。但有文献显示，VEGF在正常人组织和血浆渗出液中均有低水平，且稳定的表达[9]，我们的研究也证实了这一点。因此，虽然VEGF在肝癌转移检测中具有较好的灵敏度，但其特异性稍显不足。因此，本研究中我们同时检测了肝癌患者外周血中的EMMPRIN基因的表达。

EMMPRIN，又称CD147，为免疫球蛋白超家族成员之一,其可通过成纤维细胞刺激合成基质金属蛋白酶，降解细胞外基质，促进肿瘤的浸润与转移[10],是当前侵袭与转移机制中研究的热点之一[11-12]。已有文献证实其在肝癌组织中有较高的表达[13-15]，但有关其在肝癌患者循环血液中的表达研究还比较少。我们的研究显示，EMMPRIN与VEGF在肝癌患者中的表达相类似，与健康对照组相比，其显著高表达于肝癌组和肝癌转移组。值得注意的是，EMMPRIN基因有很好的特异性，在本研究中的健康对照组中仅有一例阳性表达，当然，其特异性到底有多高还有待于更大样本量的研究。

综上所述,检测肝癌患者外周血中VEGF mRNA对肝癌转移监测的敏感度较高，而EMMPRIN mRNA的检测对肝癌转移监测又具有较好的特异度，因此联合检测肝癌患者外周血中VEGF和EMMPRIN mRNA对肝癌的早期转移监测具有一定的应用价值。