HPLC法用于测定丁桂散中丁香酚含量研究

刘丹丹

福建中医药大学附属漳州市中医院，福建省漳州市 363000

丁桂散的组成成分主要包括两种，分别为丁香以及肉桂细粉，其被记载于1991年版的中国人民解放军医疗单位制剂规范中，其具备散寒止痛的功能，可对机体出现肠胃受寒、腹痛便泻的患者进行有效治疗[1]。中国人民解放军医疗单位制剂规范中只对丁桂散的药物形状、鉴别方法以及散剂一般检查项目进行记载，并未对丁桂散中的丁香酚含量测量方法进行有效的记录，从而使得无法对丁桂散所具备的内在质量进行有效检测[2]。在对丁香和丁香制剂含量开展测量时，以往有学者通过研究报道称，可采用的方法为高效液相色谱法[3]。但对于丁桂散中的丁香酚含量测定，目前医学报道中尚无相关记载[4]。本次研究就通过对实验进行设计，从而使丁桂散中丁香酚含量得到有效测定，报告如下。

1 仪器与材料

本次研究所应用的测量仪器为高效液相色谱仪(荷兰Philips公司生产，型号HDK5500型)，包括6447型手动进样器，6933液相色谱泵以及紫外光检测器；DK630色谱数据工作站由上海林鑫医疗设备仪器有限责任公司生产。所应用的丁香酚对照品是由省生物制品检定所提供，批号为4581-68462。丁桂散的制备单位为市第一医院，批号分别为20186748、20186750、20186781。

2 检测方法和结果

2.1 色谱条件以及系统适用性试验 本次研究所应用的色谱柱生产厂家为上海季罗普仪器设备有限责任公司，型号为DHA-H2分析色谱柱，色谱柱的大小为4.6mmID×250mm，粒径大小为10μm；所应用的C18保护柱的大小为4.6mmID×5mm，粒径大小为10μm；所应用的流动相为甲醇-10%甲醇(44:56)，流速控制为0.7ml/min，检测光的波长控制为280nm。在对色谱参数进行正确设置后，对丁香酚对照品、丁桂散色谱图以及丁桂散不含丁香的阴性样品所对应的色谱图进行测量，通过测量取得的色谱图可知，丁香酚所具备的保留时间为18min，所具备的理论板数为7 500，和丁香酚相邻峰所具备的分离度超过1.5。

2.2 线性关系以及最低检出浓度 首先应用534.7mg的丁香酚对照品，对其进行精确的测量，将其加入到量瓶中，量瓶的容量为100ml，然后向量瓶中加入乙醇，对丁香酚对照品进行溶解，并将其稀释到制定的刻度，所取得的溶液就是丁香酚对照品储备液，每毫升丁香酚对照品储备液中所具备的丁香酚含量为5.347mg，然后采用5ml丁香酚对照品储备液，将其放入到量瓶中，量瓶的容量为100ml，采用流动相对其开展稀释，使其稀释值达到267.4μg/ml，然后将量瓶进行摇晃，使瓶中的液体被充分摇匀。采用不同量的混合液加入到液相色谱仪中，加入量分别为2μl、4μl、8μl、12μl以及16μl，所出现的谱峰面积进行有效记录，根据峰面积对进样量X开展线性回归，丁香酚所应用的回归方程为：Y=3.068E+0.7X-1.763E+0.6，r=0.999 9，线性范围为0.523 6～4.399μg。然后稀释对照品溶液，稀释完成后采用相同方式进行进样，根据基线噪音2倍开展计算可知，丁香酚的最低检出量为0.01μg左右。

2.3 精密度以及重复性试验 通过将相同的对照品开展5次重复进样，对丁香酚所具备的色谱峰面积进行记录可知，RSD为0.83%。通过对相同的供试品溶液开展5次重复进样，对丁香酚所具备的色谱峰面积进行记录可知，RSD为1.79%。通过对相同的丁桂散开展5次重复进样，对丁香酚所具备的色谱峰面积进行记录可知，RSD为2.39%。

2.4 稳定性试验 通过对试品溶液进行测量，测量频率为每隔1h开展1次测量，共开展5次测量，期间共间隔4h，对丁香酚所具备的色谱峰面积进行记录，对含量开展计算，最终结果显示RSD的值为2.48%。

2.5 加样回收率试验 首先采用0.2g的丁桂散，样品量的测量必须十分精确，然后根据样品测定方法，对供试液进行制备，并将其当做开展回收测定所应用的空白样品。再另外选用0.1g丁桂散，对其进行精确的测量，然后采用25ml丁香酚对照品溶液进行加入，由于每毫升丁香酚对照品溶液中丁香酚的含量为0.267 4mg，因此25ml丁香酚对照品溶液中所含量的丁香酚剂量为6.685mg，根据样品测定方法，对供试液进行测量，将供试液作为回收测量所应用的样品，并按照相同的方法，对其他的回收测量所应用的样品进行制备，制备总数为6份。各个样品全部根据样品测定项所应用的方法，开展丁香酚含量测定，并对平均回收率开展计算，最终计算的结果为平均回收率为103.0%，RSD为1.19%。

2.6 样品测定 首先对对照品溶液开展制备，制备方法为：选用200mg的丁香酚对照品，对其剂量进行精确测定，然后将其加入到量瓶中，量瓶容量为100ml，采用乙醇溶液进行加入，对丁香酚对照品开展稀释，直至达到指定的刻度，然后将混合液进行充分摇匀。选用5ml混合液，将其加入到量瓶中，量瓶容量为50ml，采用流动相对其开展稀释，直至其达到指定的刻度，然后将其进行充分摇匀，也就制得所需要的对照品溶液，每毫升对照品溶液含有200μg丁香酚。然后对供试品溶液开展制备，制备的方法为：采用0.1g丁桂散，然后将其加入到锥形瓶中，锥形瓶的容量为100ml，采用50ml乙醇进行加入，然后开展精密称定，采用水浴的方式对锥形瓶进行加热，开展60min时间提取，然后将其放置在室温下进行冷却，等到其冷却至室温后，将加热过程中蒸发损失的溶剂进行补足，然后将溶液进行混匀，采用滤膜开展过滤，滤膜的孔径为0.45μm，也就可得到供试品溶液。然后开展测定，采用10μl对照品溶液以及10μl供试品溶液，将其加入到液相色谱仪中，对显示的色谱峰面积进行记录，应用外标法对含量进行计算。本次研究共开展3个批号样品的测量，最终结果显示丁桂散中所具备的丁香酚含量分别为97.4mg/g、99.27mg/g以及101.33mg/g。

3 讨论

丁桂散出自《外科传薪集》，丁桂散可发挥有效的温化痰湿、散寒止痛作用，其可对头痛症状进行有效治疗[5]。《青囊秘传》中有相关记载称，其无形寒湿，附骨流注[6]。临床上主要应用丁桂散对出现阴疽肿痛、腹泻、腹痛等临床症状的患者开展治疗，同时患者自身机体畏寒、肢冷，属寒相征[7]。

丁香酚所具备的分子式为C10H12O2，其为一种液体，颜色表现为无色或是苍黄色，其具备的丁香香气十分浓烈，其无法在水中进行溶解[8]。其主要应用于抗菌以及降血压治疗中。临床上在对其开展药物分析时，主要应用高效液相色谱法对药物中所存在的丁香酚含量开展测量，测量方法是通过采用无水乙醇对含有丁香酚的药物开展定容，然后将其进行浸泡，浸泡时间为24h，然后将其进行摇匀，摇匀后开展过滤[9]。在过滤完成后应用高效液相色谱分析仪开展色谱分离，应用紫外吸收检测器，确定检测波长为280nm，然后对丁香酚吸收值开展检测，并由此将丁香酚的含量进行有效计算[10]。丁香酚所具备的作用包括：(1)抗菌作用：当丁香酚的浓度保持在1∶(8 000～16 000)时，其可有效抑制致病性真菌；而当浓度保持在1∶(2 000～8 000)时，其可有效抑制金黄色葡萄球菌、志贺菌、大肠杆菌、结核杆菌等病菌[11]。(2)健胃作用：有资料报道称，5%的丁香酚乳剂可有效增加机体胃黏液分泌，且同时不会增加胃黏液的酸度，从而可发挥有效的健胃作用[12]。

HPLC法也被称之为高压液相色谱法、近代株色谱法、高分离度液相色谱法等，其属于色谱法中的一个重要分支，其是依靠液体作为流动相，应用高压输液系统，将具备不同极性的单一溶液，或是不同比例的混合溶液，缓冲液等流动相，依靠外力作用，将其加入到色谱柱中，色谱柱中具有固定相，在色谱柱中，各类成分之间发生分离，从而将色谱柱放入到检测器中开展检测，由此达到分析试样的目的。其所具备的特点主要表现为“四高一广”，首先为高压：流动相属于液体，其在色谱柱中进行流动时，其会受到较大的阻力，而若其需要以较快的速度流过色谱柱，则需要对载体施加较高的压力。其次为高速：分析速度较快，同时载体液的流动速度也较快，因此完成检测的速度也较快，在对一个样品开展分析时，通常所需的时间仅为15～30min，部分样品的分析时间仅需5min，通常情况下一个样品分析时间都不会超过1h。其次为高效：该方法具备较高的分离效能，可选择固定相以及流动相，从而使分离效果达到最佳，因此其所具备的分离效能相较于工业精馏塔以及气相色谱明显更高。其次为高灵敏度：高效液相色谱的紫外检测器灵敏度可达到0.01ng，进样量精确度可达到μl数量级。最后为应用范围广：高效液相色谱分析可对超过70%的有机化合物开展检测。丁香酚最大吸收波长在230nm，次强吸收波长在280ml，选用280nm作为侧定波长，有利于排除其他组分干扰。

综上所述，HPLC法可有效测定丁桂散中丁香酚含量，效果显著。