38例HIV抗体阳性马尔尼菲蓝状菌的分离鉴定体会

熊劲芝 张 林 袁红霞

南华大学附属郴州市第一人民医院医学检验中心微生物室，湖南省郴州市 423000

马尔尼菲蓝状菌(Talaromyces marneffei， TM)，原名马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei，PM)，是青霉菌属中一种温度依赖性双相型条件致病性真菌，主要通过竹鼠传播，流行于东南亚和我国南方地区[1]。艾滋病以及免疫力极其低下的患者常合并马尔尼菲青霉感染。近年来感染PM患者也随着 AIDS患者的增加而日益增多，重视并早期诊断意义重大。其在 25℃ 时呈菌丝相生长，产红色素，37℃ 时呈酵母相生长，当人体感染PM后，PM以具有致病能力的酵母相寄生于宿主细胞内。而分离培养出具有双相型的TM是诊断马尔尼菲蓝状菌病的金标准[2-3]。现对我院2010年6月—2017年12月收治的 38 例HIV抗体阳性的马尔尼菲蓝状菌病患者的体液及组织双相培养鉴定情况总结报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本组38例，均经体液或组织真菌培养并鉴定为TM感染，其中血培养阳性33例，骨髓培养阳性5例。男性26例，女性12例，年龄24～76岁，平均年龄52.4岁。均为ELISA初筛试验及 Western-blot 确认阳性的 HIV感染者。

1.2 培养鉴定方法 培养基为BACT/ALERT 3D全自动血培养仪配套的培养瓶(由法国生物梅里埃公司提供)，沙保罗琼脂平板与血琼脂平板培养基购自法国生物梅里埃公司。将患者血标本或骨髓标本注入血培养瓶，在BACT/ALERT 3D全自动血培养仪中孵育。阳性报警后，涂片染色镜检考虑为真菌后转种两块沙氏培养基，分别置于25℃和37℃中培养，每24h后观察1次菌落生长情况，分别取两种环境下孵育的菌落进行涂片、固定、革兰染色，并在显微镜下观察菌体形态特征。

2 结果

经BACT/ALERT 3D全自动血培养仪增菌培养，均在5d内出现阳性报警，其中24～48h报阳1株(2.6%)，48～72h报阳6株(15.8%)，72～96h报阳28株(73.7%)，96～120h报阳3株(7.9%)。接种于沙保罗培养基，分别于25℃和37℃中培养。结果：(1)25℃培养菌落呈霉菌相，生长迅速，2d左右可见灰白色绒毛状霉菌样菌落；1周左右菌落呈淡黄色绒状，中央可见黄绿色，培养基呈玫瑰红色，且随培养时间延长而逐步加深并弥散至整个培养基。染色后镜下可见菌丝细长分隔，大量帚状枝，两轮生多见，少数单轮生，分生孢子呈卵圆形或圆形，光滑，可见明显孢间连体；(2)37℃ 培养菌落呈酵母相，生长缓慢，3～4d可见边缘光滑整齐的圆形、灰白色乳酪样菌落，无色素产生。2 周后菌落增大、干扁、周围皱褶不齐。染色后镜下可见大量类圆形长形酵母样孢子，光滑，部分呈腊肠样，有少量短菌丝。

3 讨论

TM是青霉菌属中唯一具有致病性的条件致病菌，1973年被Diaalvo等发现，多见于东南亚及我国广西、广东等南方地区，是一种易引起全身播散性损害的条件致病菌，多发生在免疫低下的人群中，在艾滋病人群中更常见，TM感染率高达18.6%，是东南亚地区艾滋病患者中仅次于结核分枝杆菌和新生隐球菌的第三大机会性致病菌[4]。

TM在培养过程中的不溶血、不浑浊、产酸量极少等特征，导致难以肉眼观察确认菌落生长，而全自动血培养仪能根据培养中产气量异常做出菌落生长的阳性报警提示，现通常采用全自动血培养仪进行培养。TM在血培养瓶生长较慢，自动血培养仪培养阳性报警峰值为4d(1.5～7d)[5]，本组TM阳性瓶报警73.7%在72～96h。建议对于迟缓报警的转种后继续室温下静置观察上清液变化，若出现白色颗粒或棉絮状物，涂片检查更易找到TM特征菌，是确认TM简单有效的方法，具有重要的临床意义。

TM在体内主要侵犯人体的单核巨噬细胞系统，包括骨髓、肝、脾、肺、淋巴组织及肠道淋巴结等，其感染后只有免疫力低下的少数人发病，临床常表现为发热、咳嗽、咳痰等呼吸道症状，纳差、腹痛、腹泻、肝脾及腹腔淋巴结肿大等消化道症状，以及皮肤脐窝样坏死性丘疹、咽喉部溃疡假膜等体征[6]。艾滋病合并TM感染时，骨髓培养阳性率最高，接近100%，其次为皮肤活检(90%)和血培养(76%)，与TM首先在骨髓等单核巨噬细胞系统中大量繁殖，然后部分释放到血液中这种生物特性有关，提示在早期诊断上，骨髓培养优于血培养，可以避免部分因血培养阴性而漏诊的患者[7]。HIV阳性者血培养TM阳性率76.7%， HIV阴性率47.1%，HIV 阳性患者较阴性患者TM感染后更容易出现发热、脾脏增大、WBC下降、血小板降低、ALT 异常[8]。酵母相为致病相，在活体内可逃避寄生宿主的免疫应答，菌丝相到酵母相的转变是TM发病机制的前提，HSP70基因是双相转化相关基因。机体抵抗TM入侵主要依靠细胞免疫，组织中出现的起主要作用的是 CD4+T细胞有助于杀灭真菌及使病变局限[9]。

因此，对于HIV阳性患者，出现不明原因发热与肺部感染时，应高度重视TM感染可能，及时对其进行血液或骨髓培养。从临床标本分离培养出具有双相型的TM仍是诊断马尔尼菲蓝状菌病的金标准，但近2周的耗时及对检验人员经验技术的高要求所致的诊治延迟是其不足之处[10]。