硫酸锌对大鼠压力性溃疡TNF-α、NF-κB p65表达的影响

蒋红 樊慧婷，2 罗园园 魏军红 彭禄霞 由淑萍

(1新疆医科大学护理学院，新疆 乌鲁木齐 830000，2新疆伊宁市伊犁州友谊医院)

压力性溃疡现已成为全球医疗费用支出最高的身体衰弱并发症之一。在我国，压力性溃疡的发生率为26.2%〔1〕，虽然已把压力性溃疡是否出现作为衡量护理质量、医院等级评审、质量年检查的客观证据之一，但由于压力性溃疡防治尚缺乏科学指南，导致不同医院、科室或同一科室的不同护士对压力性溃疡防治所采取的方法也有所差异。研究表明〔2〕，黄芪注射液可以通过抑制炎症因子、氧自由基的释放，对压力性溃疡缺血-再灌注损伤具有保护作用。锌作为一种微量元素可以促进伤口愈合，且愈合速度与伤口锌的浓度呈现正相关，因此，推测硫酸锌对压力性溃疡具有防治作用，其作用机制可能与改善压力性溃疡缺血-再灌注损伤有关。本实验选择与黄芪注射液剂型相同的硫酸锌注射液，采用缺血-再灌注损伤的原理制备大鼠压力性溃疡模型，并给予不同浓度的硫酸锌进行治疗，观察超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及参与炎症反应的炎症因子肿瘤坏死因子(TNF)-α、核因子(NF)-κB p65的变化，以证实硫酸锌对大鼠压力性溃疡部位的保护作用及其可能发生的作用机制，为临床预防和治疗压力性溃疡提供合理、安全、有效的理论依据。

1 材料与方法

1.1材料及主要仪器 硫酸锌晶体(7733-02-0，西安泰华医药有限公司)(硫酸锌晶体0.2 g+200 ml生理盐水混匀，此时浓度为1 mg/ml，灭菌后备用)；黄芪注射液(相当于原生药20 g，A03171009，黑龙江珍宝岛药业)；SOD测定试剂盒(001-3，南京建成生物工程研究所)、MDA测定试剂盒(A003-1，南京建成生物工程研究所)；TNF-α测定试剂盒购自杭州联科生物技术股份有限公司；NF-κB p65抗体购自北京博奥森生物公司；二步法(通用型)检测试剂盒PV-6000、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购自中杉金桥生物公司。低温离心机；数显恒温水浴锅；酶标仪。

1.2实验动物 SPF级SD大鼠，雄性，60只，体重180～220 g，由新疆医科大学实验动物研究中心提供。动物生产许可证号SCXK(新) 2011-0004。SPF环境实验动物使用许可证号：SYXK(新)2011-0004，饲养受控环境条件(21～23℃，湿度50%～70%)，通风良好，常规饲养。

1.3大鼠压力性溃疡模型的制备 参考姜丽萍等〔3〕压力性溃疡模型制备方法。造模前大鼠禁食12 h，自由饮水，腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，大鼠双后肢脱毛处理。之后将大鼠仰卧受压于压力性溃疡加压装置上，给予3个周期的I/R(I=缺血2.0 h,R=再灌注0.5 h)，合计7.5 h。

1.4分组与用药 将大鼠随机分为6组，正常对照组、压力性溃疡模型组、黄芪阳性对照组(10 ml/kg)〔4〕、硫酸锌高、中、 低剂量组(10.0、5.0、2.5 ml/kg)，每组10只，除正常对照组外，其余组均进行大鼠压力性溃疡模型的制备。造模成功后次日，黄芪阳性对照组和硫酸锌高、中、低剂量组分别给予黄芪注射液和硫酸锌注射液，注射部位选定为大鼠压力性溃疡周围股薄肌朝向腹腔处，腹腔注射，正常对照组不给予任何处理，模型对照组给予生理盐水10 ml/kg注射，1次/d，持续15 d。

1.5指标的观察 ①压力性溃疡面积测定：三个循环结束时与每天给药前，肉眼观察受压部位皮肤的完整性(破损面积)和皮肤颜色变化。②血清SOD、MDA、TNF-α含量测定：心脏取血后，分离血清于-70℃冰箱冻存待测，按照试剂盒说明书步骤操作，在酶标仪波长450 nm处测定SOD、MDA吸光度，在630 nm处测定TNF-α吸光度。③苏木素-伊红(HE)染色观察压力性溃疡组织病理变化：在4%多聚甲醛中固定7 d后，进入脱水、透明、浸蜡程序后，进行石蜡包埋、切片(3～4 μm厚)、60℃恒温箱烤片、脱蜡、HE染色、乙醇梯度脱水、透明、封胶、观察。压力性溃疡分为3级：1级肌纤维排列紧密，横纹清晰，少量炎症细胞浸润，无水肿；2级可见较多炎症细胞浸润，肌纤维轻度水肿，横纹欠清晰；3级肌纤维亦见明显炎症细胞浸润，水肿明显，间质增宽，横纹模糊。④免疫组化法测定压力性溃疡组织中NF-κB p65因子的变化：采用SP法进行免疫组化染色，将切片按脱腊，3%过氧化氢(H2O2)消除内源性过氧化物酶的活性，微波中低火3 min、中火7 min、中高火2 min进行抗原热修复，山羊血清封闭液封闭30 min，滴加Ⅰ抗(1∶500) 4℃过夜，20%～30%蛋清液50 μl消除内源性生物素，滴加Ⅱ抗，DAB显色，苏木素复染，乙醇梯度脱水，透明，胶封的方法进行NF-κB p65因子的免疫组化分析。采用Nikon DIGITAL SIGHTDS-Fi2型生物显微镜进行观察、K12320型显微摄像系统选取清晰视野拍照。结果判定：阳性表达为细胞核与核内出现棕黄色颗粒。每张切片随机选取3个视野(高倍镜×400)，每个视野随机选取5个2 cm×3 cm大小的范围，参照Fromowitz评分法〔5〕，综合光密度值(MOD,即：细胞核阳性的细胞染色深度)和染色范围两种测定结果进行统计：①0分=无着色，1分=淡黄色，2分=棕黄色，3分=棕褐色；②0分即染色范围<5%，1分即染色范围5%～25%，2分即染色范围26%～50%，3分即染色范围51%～75%，4分即染色范围>75%。测定结果中①+②：<2分为阴性(-)，2～3分为弱阳性(+)，4～5分为中度阳性()，6～7分为强阳性()。

1.6统计学方法 采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1大鼠压力性溃疡模型的制备 通过3个周期、历时7.5 h对大鼠股薄肌的压迫，可以成功复制大鼠压力性溃疡模型。可见压力性溃疡部位出现明显的红肿破溃，皮肤完整性受损甚至有小水泡形成。造模后大鼠皮肤呈现红紫状，可见皮肤已游离于皮下组织，水泡若隐若现，造模次日，即可见水泡破溃，皮肤防御防线受损。见图1。

2.2硫酸锌对压力性溃疡大鼠疮面的愈合作用 造模后14 d，模型组可见疮面组织明显且深，部分部位可见感染，与模型组比较，黄芪阳性对照组及硫酸锌不同剂量组的疮面均明显好转，其中，硫酸锌高剂量组皮肤颜色已经接近正常对照组，与黄芪阳性对照组效果相当，硫酸锌中、低剂量组仍有少量皮肤破损，但大部分皮损已经处于结痂阶段，表明，硫酸锌具有一定的促进疮面愈合、促进生肌的作用。见图2。

2.3硫酸锌对压力性溃疡大鼠血清中SOD、MDA含量的影响 与正常对照组比较，模型组SOD值明显下降、MDA值明显上升，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，黄芪阳性对照组、硫酸锌高、中、低剂量组SOD值均明显上升、MDA值明显下降(P<0.05)，其中硫酸锌不同剂量组中，以高剂量组的SOD、MDA含量与正常对照组最为接近，提示：硫酸锌具有一定的清除压力性溃疡疮面氧自由基、修复疮面损伤细胞的功能。见表1。

2.4硫酸锌对压力性溃疡大鼠血清中TNF-α含量的影响 与正常对照组比较，模型组TNF-α含量明显上升，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，黄芪阳性对照组、硫酸锌不同剂量组TNF-α含量均显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)，提示TNF-α可能参与了压力性溃疡的病理过程，硫酸锌可以促进压力性溃疡疮面的愈合。见表1。

2.5硫酸锌对大鼠压力性溃疡组织治疗效果的病理学观察 病理HE染色显示，正常对照组结缔组织疏松，无炎细胞浸润、血管扩张及充血等，模型组可见大量炎症细胞浸润，血管扩张、充血明显；与模型组比较，黄芪阳性对照组可见有少量的炎细胞，硫酸锌高剂量组可见少量的炎细胞、血管扩张充血减轻、并有新生血管出现，中、低剂量组炎性细胞浸润较少，血管扩张也有所减轻。见图3。

图1 大鼠压力性溃疡模型的制备

图2 造模结束后14 d各组压力性溃疡疮面的形态学变化

组别TNF-α(pg/ml)SOD(U/ml)MDA(nmol/ml)正常对照组708.84±54.75131.56±4.972.64±0.74模型组1382.04±174.002)83.16±3.071)13.13±1.681)黄芪阳性对照组801.24±21.734)121.41±2.423)5.72±0.673)硫酸锌高剂量组809.77±12.964)111.99±2.343)4.70±0.883)中剂量组902.55±26.094)105.11±2.103)7.13±0.803)低剂量组1101.30±54.174)94.08±3.413)10.08±0.793)

与正常对照组比较:1)P<0.01，2)P<0.05；与模型组比较:3)P<0.01，4)P<0.05

2.6硫酸锌对大鼠组织中NF-κB p65蛋白表达的影响 免疫组化结果表明，正常对照组大鼠肌肉组织中细胞核及核内基本无着色，呈阴性；模型组中可见细胞核与核内出现大量的弥漫型、灶型、片簇型棕黄色颗粒，表达呈现强阳性；与模型组比较，硫酸锌不同剂量组的细胞核及核内表达较模型组明显减少且着色浅，其中高剂量组的效果与黄芪阳性对照组相当，呈现弱阳性。见图4。

图3 硫酸锌对大鼠压力性溃疡组织治疗效果的病理学观察(×100)

图4 硫酸锌对SD大鼠组织中NF-κB p65蛋白表达的影响(×400)

3 讨 论

研究表明，压力和营养因素是压力性溃疡发生最为关键的两大因素，同时，压力性溃疡相对于其他溃疡而言，有难愈合的特点，一直是护理领域的重要难题之一。锌作为与伤口恢复最为密切的元素之一，硫酸锌对于伤口恢复及骨折修复有着不俗的疗效。锌具有多种重要的生理功能，是人体必需的微量元素之一〔6〕。本研究通过成功制备大鼠压力性溃疡模型，研究不同剂量的硫酸锌剂量组对于大鼠压力性溃疡部位的保护作用，并与黄芪注射液的疗效进行比较，以探索硫酸锌对于压力性溃疡的治愈效果及其可能机制。本研究结果证明，硫酸锌对于大鼠压力性溃疡部位有一定的保护作用，其中硫酸锌高剂量组压力性溃疡愈合最好，与黄芪阳性对照组效果相当；硫酸锌中剂量组次之。推测是由于硫酸锌中的锌离子，可以参与体内清除氧自由基、免疫调节等过程，增加了机体抵抗力、从而促进压力性溃疡部位的愈合。

SOD作为自由基清除剂的关键酶对机体的氧化和抗氧化平衡起着重要作用。SOD能够清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤，其活性在一定程度上间接反映了机体清除氧自由基的能力。MDA是氧自由基作用于生物膜多聚不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应的产物。氧自由基不仅通过多聚不饱和脂肪酸过氧化引起细胞损伤，还可以通过脂质过氧化物的分解产物引起细胞损伤。本实验结果发现：随着硫酸锌剂量的增加，SOD的活性逐渐增加，MDA的含量逐渐减少，表明，在压力性溃疡发生时，可产生成大量的超氧阴离子自由基，导致细胞膜及细胞相关成分出现氧化损伤，硫酸锌可减轻氧化应激的组织损伤过程，从而达到了对于受损皮肤的修复作用。

TNF-α作为一种促炎症细胞因子，在压力性溃疡组织中的作用是使炎性细胞聚集到局部炎症组织，引起血管炎性反应；NF-κB p65作为一类核内的炎性转录因子家族，精密的调控着炎性反应和凋亡信号，参与了压力性溃疡组织损伤的病理改变过程〔7〕。本研究结果显示，持续的压力可以启动炎症级联反应，使模型组TNF-α表达增高，同时，NF-κB在凋亡过程中属于下游调节因素，TNF-α可以通过NF-κB发挥调节作用，故模型组NF-κB p65蛋白表达呈现强阳性。本研究结果还显示，硫酸锌可以使血清中TNF-α表达含量降低，使NF-κB p65蛋白表达强度下降，推测，硫酸锌可以对压力和氧化应激等外界刺激产生强大的调节作用，使TNF-α表达降低，继而抑制NF-κB调控枢纽，减少细胞凋亡，共同阻止组织向不可逆损伤方向发展、促进压力性溃疡疮面的愈合过程。

其作用机制可能与增加SOD活性、降低MDA含量，进而增加了机体清除氧自由基的能力及抑制TNF-α、NF-κB p65的表达，通过TNF-α与相关受体结合进一步抑制了NF-κB介导的凋亡通路，阻止组织中细胞凋亡的发展，促进肉芽组织的增生，从而起到促进压力性溃疡疮面愈合的作用。

本研究的局限性在于仅在动物层面探讨了硫酸锌对促进压力性溃疡疮面的愈合作用，如果能在临床上进行运用，加以一些传统的压力性溃疡治疗方法，如翻身、按摩、擦洗、热敷及加强营养等，效果可能更好，在以后的研究和工作中将进一步进行研究和探讨。