软骨仿生环境下的培养在软骨组织工程中的研究进展

袁礼波 综述 徐永清 审校

（1.昆明医科大学；2.中国人民解放军联勤保障部队第九二〇医院，云南 昆明 650032）

关节软骨为透明软骨，富有弹性，摩擦因数小，能吸收关节间振荡，是维持关节功能的重要结构，临床上因多种原因导致的关节软骨缺损的发病率很高，由于关节软骨中无神经、血管，自愈能力较差，因此，关节软骨自身修复能力有限，即使是小的关节软骨损伤也可能导致关节软骨退行性病变[1]。目前的治疗方法如软骨移植、微骨折等已经被广泛的应用于关节软骨的损伤修复[2]，但是，研究结果显示，这些方法都存在一些技术上的局限性，均不能实现长期的软骨修复。此外，关节软骨自我损伤的修复部位主要由纤维软骨填充而不是透明软骨，其最终结局还是修复部位软骨的退化坏死，因此，组织工程在软骨再生方面具有很大的发展潜力。多种种子细胞均可诱导出软骨细胞，但在软骨组织工程中，从正常组织中分离得到的种子细胞在不同的物理、化学等条件下，得到的细胞差异较大，主要表现在种子细胞扩增培养后与天然软骨组织的匹配度、修复区力学强度不同等，这些复杂的因素均困扰着软骨组织工程的发展和应用。因此，归纳分析目前已知的各种对软骨体外培养产生影响的因素，并展望一个行之有效的组合方法，通过仿生环境的研究进一步推进组织工程在软骨修复研究中的发展方向。

一、种子细胞

软骨组织工程的是将少量活组织作为种子细胞，将其体外培养扩增后并植入病损部位，以达到损伤修复和功能重建的目的，其包括三大要素：成软骨相关种子细胞、信号分子、支架材料等。

目前研究较多的种子细胞包括骨髓间充质干细胞、肌肉干细胞、干细胞衍生的外泌体(stem cell-derived exosomes，SC-Exos)、脂肪干细胞、胚胎干细胞等,多种种子细胞均可诱导生成接近正常软骨的细胞，但与培养过程中的多种因素相关，且差异较大。最新研究[3-5]发现，干细胞并不是直接增殖、分化成软骨组织，而更可能是通过旁分泌形式分泌细胞外囊泡的方式发挥功能，SC-Exos可以诱导周围细胞发生遗传变化，并起调节作用，如促进其增殖或抑制细胞凋亡。以上研究说明，若SC-Exos在软骨缺损部位保持其有效浓度，可促进软骨细胞增殖，从而持续有效地修复和再生软骨组织。

二、生长因子

探索出对细胞增殖有调节作用的细胞因子已经成为骨软骨组织工程的重要环节。骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)、转化生长因子（transforming growth factor，TGF）、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、胰岛素样生长因子等在骨软骨缺损的修复过程中发挥了重要作用。其中，BMP-2成骨潜力巨大，是促进骨骼再生的关键因素，An G等[6]制备明胶/聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid，PLGA)纳米复合支架并将VEGF和BMP加载在支架中，使生长因子在修复骨软骨缺损可以持续释放，结果显示，VEGF和BMP可以促进BMSCs在支架上的黏附、增殖和分化。赵丹丹等[7]获取人骨髓间充质干细胞（human bone marrow-derived mesenchymal stem cells,hBMSCs）后，分别用DMEM和DMEM+碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF） 培养基进行培养。DMEM+bFGF培养体系下的细胞形态、细胞得率及成软骨能力等方面均优于DMEM组。DMEM+bFGF培养体系下，按照1∶3传代的细胞传至第6代仍能维持较好的细胞形态；第1～4代细胞均表达软骨特异性细胞外基质Ⅱ型胶原，第5及后续代次的细胞成软骨能力较差。此外，蒋萍等[8]发现Ⅱ型胶原蛋白包被培养板在培养软骨细胞时更能维持细胞形态，延长去分化现象出现的时间，更利于细胞再分化。康健等[9]发现富血小板凝胶萃取液中 PDGF-AB、TGF-β1、IGF-1、VEGF 生长因子浓度明显高于全血，富血小板凝胶与软骨细胞复合培养，软骨细胞增殖速度明显高于普通培养软骨细胞。由此可见在体内，细胞的新陈代谢和功能的发挥时刻受到来自微环境的信息调控，包括来自周围细胞、细胞外基质或因子中的生化信息、生物力学和生物电刺激信号等[10]，因此出现了共培养的概念，其初衷是在体外环境下模拟体内细胞微环境，促进细胞间信息交换和功能仿生组织的生成，但是，软骨组织工程共培养系统中细胞间相互作用的具体机制仍不清楚。介于多种生长因子的不同作用机理，可认为只应用一种或少数生长因子往往达不到多方位同时促进软骨向正常软骨生长的目的，只有不断模仿正常生物的体内环境，才能增加软骨体外培养的满意度。

三、载体

目前用于组织工程支架的材料主要有天然生物材料、人工合成高分子材料和复合材料3大类。单纯应用天然生物材料或人工合成高分子材料存在诸多问题，如生物力学不足及免疫反应等；将两种或两种以上具有互补特性的材料进行复合，并选择合适的制备工艺，可以设计构造出能够满足软骨组织工程所需的三维支架。而三维支架的研究仍处于初级阶段，从已有研究文献报道的支架类型从结构上大致分为以下三类，单相支架、双相支架、复合多相一体化支架。其中骨-软骨一体化的单相支架又可同时修复软骨与软骨下骨，如段平国等[11]用一体化双层聚乳酸/羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)多孔支架材料，采用室温模压/粒子浸出法制备一体化双层多孔支架，8周后见支架上层纤维组织中夹杂有少量软骨细胞，下层可见大量骨小梁样组织形成，上下层组织紧密结合，支架部分降解。鹿亮等[12]用猪软骨细胞接种至脱细胞软骨细胞外基质（acellular cartilage extra cellular matrix，ACECM） 取向支架，体外构建组织工程软骨，再将软骨细胞-支架复合物植入裸鼠背部皮下腔隙，术后4周，大体观察见复合物呈类软骨样组织，组织学染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色示细胞周围软骨细胞外基质分泌，可见ACECM取向支架有利于软骨细胞的黏附、增殖及取向性分布类似于正常软骨结构，并在裸鼠皮下成功异位构建组织工程软骨。邓天政等[13]制备了明胶-硫酸软骨素-透明质酸及明胶-陶瓷化骨-软骨复合多相支架，发现兔软骨细胞在复合支架上生长良好，但该方法的不足是其产生的微孔大小难以控制。Yang X等[14]将氧化的海藻酸盐作为大分子交联剂制备胶原水凝胶支架，结果显示乳兔关节软骨细胞在交联的胶原水凝胶支架上生长良好，并保持细胞表型，但该技术的不足是所制备的支架强度不高，并且常因吸水而变形，不能很好地促进细胞增殖。李建伟等[15]以猪源脱细胞软骨细胞外基质、纳米级羟基磷灰石和海藻酸钠为原材料，按不同成分比例混合，利用冷冻干燥技术和物理化学法交联，制备出以脱细胞软骨细胞外基质为软骨层，海藻酸钠和脱细胞软骨细胞外基质为中间层，纳米级羟基磷灰石、海藻酸钠和脱细胞软骨细胞外基质为骨层的骨软骨一体化多相支架，实验结果显示该骨-软骨一体化多相支架具有良好的生物学与力学特性，但需要进一步的动物实验观察修复效果。这些相对传统的方法在制备由多种材料不同结构的各相层组成的非均相支架方面仍存在缺陷。近年来，采用3D打印技术制备多孔隙支架已成为研究热门，3D打印可精确定制外形和尺寸符合需要的植入体。运用3D打印技术制备的支架材料，不仅外形可控，其内部孔隙结构、大小、分布亦简单易调，而且支架材料的组合自由多样，可以实现骨与软骨组织在结构和组份上的高度模拟。此外，3D生物打印技术也带来了组织工程领域内新的一场技术革命，能够将细胞和生物材料作为生物打印墨水，精确复制目标组织生理结构。

四、其他影响因素

在适当的时间范围内施以适当的压力可以促进单层培养的软骨细胞增殖和基质的分泌，而超过一定的限度则会产生抑制的作用。Falsafi S等[16]研究发现软骨细胞在微重力状态下能迅速增殖，在短时间内分裂达较高的数量级别，克服了常规的培养时间长、增殖慢的缺点。气体环境对软骨细胞培养的影响早就被人们所认识，骨髓间充质干细胞向软骨细胞诱导时也不例外。赵萤等[17]采用成软骨诱导液培养同时每天给予120kPa压力刺激1h，4周后采用Electro Force systems 3200力学测量仪测量其弹性模量，发现压力作用下的骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)复合富血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin,PRF)双膜复合体所构建的组织工程软骨其弹性模量较其他组更接近天然软骨。此外，使用外源性机械压力作用于移植的软骨细胞及其基质，可以使用静水压力[18]和动态压缩[19]方法改善基质成熟和新组织功能。但人在步行过程中，作用于人膝盖软骨的压力是人体质量的4～5倍，而软骨细胞是通过增殖和产生细胞外基质来应对高机械负荷。因此软骨组织工程中关键之一在于找到合适的力学载荷;既要满足组织代谢和传质的要求;又要模拟关节运动,对软骨产生适当的、耦合的力学载荷和生化刺激,促进工程软骨的功能化构建，有研究发现氧浓度过高、过低都不利于软骨细胞生长、繁殖及代谢，但具体氧浓度高低难以提出具体的数值，总而言之，仅仅提供这些条件尚未能满足软骨细胞维持正常生长的需求[20]，因为各因素对组织工程软骨生物学效应的具体机制仍不清楚，因此体外仿生环境下模拟体内细胞微循环的培养系统的提出，是需要不断深入的研究方向。

五、总结

在组织工程软骨体外培养过程中，种子细胞、生长因子、营养物质与代谢产物、温度、酸碱环境、氧分压、CO2浓度等各种生化因素的变化都会造成培养条件的改变，进而影响软骨体外构建的结果，而这些理化条件、应力及支架材料等各因素之间又相互联系，相互影响，共同作用于工程软骨，因此，在软骨组织工程体外构建过程中需要充分考虑各因素之间的关系，包括力学载荷、生化刺激之间的协同作用或拮抗作用等，以进一步营造仿生培养环境。