猕猴桃叶枯病病原菌广谱拮抗菌株的筛选与鉴定

付 博，王家哲，张 锋，李英梅，任 平,2

(1.陕西省生物农业研究所 有害生物监测与防控研究中心，陕西 西安 710043；2.陕西省酶工程技术研究中心，陕西 西安 710600)

陕西省是我国的猕猴桃种植大省，随着猕猴桃产业的迅猛发展，猕猴桃病害也不断加重。近年来猕猴桃细菌性叶枯病成为新兴的猕猴桃主要病害，研究发现其病原菌为丁香假单胞菌丁香致病变种(Pseudomonassyringaepv.Syringae)，该病主要危害猕猴桃叶片，轻时个别叶片表现出局部枯死症状， 重时则大部分叶片干枯死亡，严重影响果树的生长及果实的品质[1, 2]。

传统的猕猴桃叶枯病防治主要采用化学药物防治，但由于生产过程中长期大量使用化肥、农药，果园生态环境严重恶化，果树营养供给不足，果树自身对各种病虫害的抗性能力减弱，产品农药残留的污染日渐严重，并影响了猕猴桃的生产、产品外销、威胁人的健康和产业的可持续发展[3]。近年来国内外积极探索并采用以微生物为主要拮抗物质进行植物病害防治，通过菌体和植物病害之间的相互作用研究证明了应用生物防治技术保护重要经济作物是十分可行的，此外生物防治采用微生物菌株作为拮抗物质，具有可扩大培养、节约经济和没有副作用的优点[4]。

用于植物病害防治的拮抗微生物种类较多，包括放线菌[5]、芽孢杆菌和假单胞菌等，而由于芽孢杆菌自身能够产生耐高温、耐酸碱，抗逆性极强的芽孢而受到广泛关注并作为生防菌剂被大量投放到实际生产应用中[6, 7]。目前已分离鉴定出来的对猕猴桃叶枯病有拮抗作用的菌种仍十分有限，而且现有菌种的抗病能力良莠不齐，因此，本研究拟从猕猴桃根际土壤中筛选出对猕猴桃叶枯病具有广谱拮抗作用并且抗性较强的芽孢杆菌并对其进行鉴定。从而不断丰富现有的拮抗菌株资源，积极促进生物防治技术在提高猕猴桃树防病、抗病能力方面发挥更大的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 土样 按常规方法采集陕西眉县、周至县和西安临潼区猕猴桃园果树根际土壤。

1.1.2 供试病原菌 猕猴桃细菌性病原菌，丁香假单胞菌丁香致病变种(编号1336)(Pseudomonassyringaepv.Syringae)，猕猴桃细菌性溃疡病病原菌(编号2102)(Pseudomonassyringaepv.actinidae)，菌种来源：购于中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所。植物常见真菌性病原菌，猕猴桃灰霉病病原菌F3(Botrytiscinerea)、黄瓜枯萎病病原菌F5(Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)、甜瓜枯萎病病原菌F7(Fusarimaxysporiumf.sp.melonis)、苹果斑点落叶病病原菌F9(Alternariaalternataf.sp.Mali)、辣椒疫病病原菌F11(Phytophthoracapsici)菌种来源：由西北大学生命科学学院微生物实验室友情馈赠。

1.1.3 主要试剂和仪器 PCR所用Buffer、dNTP、Taq酶等购自北京鼎国生物技术公司，限制性内切酶EcoR I 购自Takara公司，克隆载体pGEM-T Easy购自Promega公司，氨苄青霉素(Amp)、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、琼脂糖等购自Wolsen公司，细菌基因组DNA提取、质粒提取、琼脂糖凝胶回收试剂盒均购自Biotake公司，其他常规实际均为国产分析纯。离心机Centrifuge5415D、Centrifuge5810R、pCR仪、微量可调移液器、电转化仪 Eleetroporator2510均购自Eppendorf公司，DNA mini购自Heto-Holten公司，凝胶成像系统购自SYNGENE公司，电泳仪购自Bio-RAD公司，恒温摇床、培养箱、水浴锅等均为国产仪器。

1.2 菌株分离和筛选

1.2.1 根际土壤中芽孢杆菌的分离筛选 土样经室温干燥后称取25 g放入225 mL含有少量玻璃珠的无菌水振荡30 min，样品悬液经80 ℃水浴加热20 min，取0.1 mL稀释涂布牛肉膏蛋白胨平板，30 ℃倒置培养48 h，挑取单菌落划线、编号保藏备用。

1.2.2 具有拮抗作用的菌种初筛 以猕猴桃叶枯病病原菌为拮抗对象，采用抑菌圈法[2]，每个待筛菌株4个重复，并利用SPSS软件进行生物统计分析[8]。

1.2.3 具有拮抗作用的菌种复筛 为进一步确定无菌发酵液上清对猕猴桃叶枯病病原菌的拮抗作用，摇瓶发酵液12 000 r/min离心10 min，取上清，采用细菌过滤器(0.22 μm)过滤除菌，制备无菌的发酵液上清，采用牛津杯法进行复筛，每个待测菌株设置4组重复，测量抑菌圈直径，取平均值[2, 9]。

1.2.4 拮抗菌的抑菌谱检测 以最常见的猕猴桃细菌性溃疡病病原菌(Pseudomonassyringaepv.actinidae)为检测对象，采用抑菌圈法检测菌株拮抗效果；以猕猴桃灰霉病病原菌F3(Botrytiscinerea)、黄瓜枯萎病病原菌F5(Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)、甜瓜枯萎病病原菌F7(Fusarimaxysporiumf.sp.melonis)、苹果斑点落叶病病原菌F9(Alternariaalternataf.sp.Mali)、辣椒疫病病原菌F11(Phytophthoracapsici)5种常见的植物真菌性病害为检测对象，采用平板对峙法检测菌株拮抗效果，30 ℃培养5 d，测量真菌圆形菌落边缘为起止的直径，以未接拮抗菌的真菌平板为对照，计算抑菌率[2, 10]。

抑制菌=

1.3 菌株鉴定

1.3.1 菌体形态观察及生理生化实验 筛选出对猕猴桃叶枯病具有广谱拮抗作用的菌株并参照文献[11]方法观察菌体形态并测定生理生化特征。

1.3.2 16S rDNA序列测定 使用Biotake细菌基因组DNA提取试剂盒抽提菌体基因组DNA，采用细菌鉴定通用引物27F(正向引物：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)/1492R(反向引物：5’-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’)进行16S rDNA的PCR扩增。PCR扩增条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min、57.5 ℃ 1 min、72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 10 min。扩增产物用Biotake柱式DNA凝胶回收试剂盒进行切胶纯化。切胶纯化产物连接pGEM-T Easy载体，电转化大肠杆菌JM109感受态细胞，通过蓝白筛选得到阳性质粒转化子，提取质粒并进行EcoR I单酶切验证，将质粒送上海生工进行测序，序列提交NCBI网站获得GenBank登陆号[12-13]。

1.3.3 系统发育树的构建 将菌株16S rDNA序列通过BLAST与NCBI网站GenBank中已知的序列进行同源性分析，利用DNASTAR(MegAlign)将序列进行对位排列，并手工适当校正，MEGA3.1分析碱基组成，并以Kimura22参数计算遗传距离，采用Nj邻近法构建系统进化树[14]。

2 结果与分析

2.1 对猕猴桃叶枯病有拮抗作用的芽孢杆菌初筛

按上述方法，从猕猴桃根际土壤中共分离出31株对猕猴桃叶枯病病原菌(编号1336)有拮抗作用的芽孢杆菌，其中抑菌圈直径大于0.5 cm占总数的82%(图1)。

图1 菌株MX3-11对猕猴桃叶枯病病原菌的拮抗作用

2.2 对猕猴桃叶枯病有拮抗作用的芽孢杆菌的复筛

以初筛的对叶枯病病原菌(编号1336)有拮抗作用的31株芽孢杆菌为研究对象，检测拮抗菌株的发酵液上清对致病菌的抑制作用。结果显示，初筛的拮抗菌中有3株菌MX3-11、TJKB-24和NF2的无菌发酵液上清对叶枯病病原菌(编号1336)具有明显的抑制作用，抑菌圈直径均>0.5 cm(表1)。

表1 发酵液上清对病原菌的抑制作用

2.3 菌株抑菌谱检测

采用直接点样法和平板对峙法检测已筛选的菌株对猕猴桃溃疡病病原菌和其他5种常见真菌性病原菌的拮抗作用，结果显示，菌株MX3-11、TJKB-24和NF2对猕猴桃溃疡病病原菌的抑菌圈直径大于0.5 cm占总数的80%；对真菌性病原菌均表现出不同程度的拮抗能力(表2)，这3株菌对F5黄瓜枯萎病病原菌的抑制作用最强，抑菌率均大于60%，而对F9苹果斑点落叶病病原菌的抑制作用较低，均小于33%。说明菌株MX3-11、TJKB-24和NF2的抗菌谱较广，具有较大的应用潜力。

表2 抑菌率的计算

图2 菌体及芽孢显微摄影(100倍)

2.4 菌株的鉴定

2.4.1 菌株形态和生理生化特征 菌株MX3-11、TJKB-24和NF2的各项基本特征均表现出高度的一致性，菌株均为革兰氏阳性杆菌，大小约0.87 μm ～1.18 μm×2.50 μm ～6.00 μm，好氧，周生鞭毛，产芽孢，菌落圆形、表面光滑、乳白色(图2)。3株菌体的生理生化特征相同见表3。

表3 菌株生理生化特征

2.4.2 菌株MX3-11、TJKB-24和NF2的16S rDNA序列分析及菌种鉴定 菌株MX3-11、TJKB-24和NF2的16S rDNA序列长度分别为1 449 bp、1 450 bp和1 452 bp。将序列提交NCBI基因库，获得GenBank登陆号分别为KC495121、KC495122和KC495120。以菌株MX3-11、TJKB-24和NF2的16S rDNA 序列为基础构建系统发育树(Nj树)，结果显示这3株菌与美丽短芽孢杆菌位于同一个进化分枝，同源性100%。因此，鉴定菌株MX3-11、TJKB-24和NF2均为美丽短芽孢杆菌(Brevibacillusformosus)。[15-16]

图3 以菌株MX3-11、TJKB-24和NF2的16SrDNA序列为基础的系统发育树

3 结论与讨论

随着猕猴桃叶枯病的主要病原菌被确定，人们逐步开展拮抗菌种选育工作以期能够筛选出具有生物防治作用的生物菌剂，从而达到对猕猴桃病害的田间防治目的。李娟[2-3]从猕猴桃根际土壤分离筛选出2株对猕猴桃叶枯病病原菌具有拮抗作用的菌种，分别鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和巨大芽孢杆菌(Bacillusmegatherium)，通过田间小试试验研究证实了菌株的抗病作用十分有效。杨灵红[17]将对猕猴桃叶枯病具有拮抗作用的巨大芽孢杆菌进行了He-Ne激光诱变，将菌株的拮抗能力提高了26.61%。目前，国内主要针对猕猴桃叶枯病的生防菌剂研究仅限于这三篇报道，而国外暂未见相关报道。

笔者研究从猕猴桃根际土壤中筛选出菌株MX3-11、TJKB-24和NF2，其对猕猴桃叶枯病病原菌具有明显的拮抗作用，此外对猕猴桃溃疡病病原菌、常见真菌性病原菌也具有较强抑菌效果，抗菌谱较广。这3株菌能够代谢产生胞外活性物质，菌株的无菌发酵液上清对猕猴桃细菌性病原菌抑菌作用明显，已有报道显示短芽孢杆菌能够产生广谱且种类多样的次级代谢产物[18]。因此，菌株MX3-11、TJKB-24和NF2具有良好的开发和应用价值。

通过菌体形态、生理生化试验和16S rDNA序列分析将菌株MX3-11、TJKB-24和NF2均鉴定为美丽短芽孢杆菌(Brevibacillusformosus)。这3株菌的筛选和鉴定极大的丰富了现有的对猕猴桃叶枯病具有拮抗作用的菌种研究，为开发新型拮抗生物菌剂奠定了重要基础。

1995年美丽短芽孢杆菌(Brevibacillusformosus)被鉴定为新种[15]，然而多年来尚未见该菌种的生防研究报道，但是近几年国内外研究人员正初步开展短芽孢杆菌属的抗病促生机制研究[19-21]，这些研究成果将为探索美丽短芽孢杆菌(Brevibacillusformosus)的生物拮抗机理提供重要的借鉴，从而积极促进对该菌种的全面而深入的研究。