TiN／Ag复合抗菌涂层与微沟槽形貌对HGFs的生物相容性和抗菌性能研究

赖颖真 周麟 陈江

牙种植体穿过牙龈的上皮和结缔组织到达骨内，形成了2个界面：种植体骨组织界面，种植体软组织界面。其中种植体软组织愈合良好有利于形成良好的边缘封闭及阻止细菌入侵的作用。研究发现口腔黏膜的上皮细胞具有沿着种植体根方迁移的趋势，良好的结缔组织愈合有利于阻止上皮的根方迁移［1］，课题组研究［2］发现种植体穿龈部分的微沟槽结构有利于引导结缔组织的牙龈成纤维细胞顺着沟槽生长紧束牙龈结缔组织，然而沟槽结构一定程度上增加了材料的表面积，从一定程度上增加了细菌黏附的可能，如何在微沟槽上面制作合适的纳米抗菌涂层是本研究的重点。研究发现银（Ag）具有良好的抗菌性能，但影响细胞的生物相容性，氮化钛涂层的细胞生物相容性较好，但抗菌性能略差［2］，本研究利用2种涂层的优缺点，在60 μm宽，10μm深的沟槽结构表面，利用磁控溅射技术制作5%Ag的TiN／Ag的纳米复合膜（TiN／Ag-MG），研究新的材料表面对牙龈成纤维细胞生物活性及牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，Pg）抗菌性能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料的准备及理化性能检测

60μm宽，10μm深的微沟槽表面硅片制作方法同课题先前［3］，JS-3X-100B磁控溅射台，扫描电镜（FE-SEM）（LEO1530，Zeiss，德国），原子力显微镜（AFM）（Agilent，5500，美国），亲水性测量仪（KRUSS DSA30），X射线光电子能谱仪（XPS）（Thermo Scientific ESCALAB 250，美国），电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）（DRC-e，PE公司，美国）。

利用磁控溅射台，对照组选择（Ti靶），溅射200 nm钛，实验组选择Ti靶+Ag靶，溅射气体为高纯度氮气，通过调节Ag靶功率条件Ag含量为5%。材料面积为2 cm×2 cm。

扫描电镜放大倍数500倍观察材料表面微沟槽形貌，原子力显微镜（测量范围2μm×2μm），观察涂层表面纳米形貌，测量纳米级粗糙度。利用XPS分析各种涂层表面（测量范围2 mm×3 mm）的元素含量价态与结合方式。利用ICP-MS测量TiN／Ag-MG材料表面Ag+离子释放：将材料浸泡在10 ml纯水中，测量1、3、5、7 d的Ag+释放量。每次测量完后更换新的纯水，每个时间点重复测量3次。材料的底面积为1 cm2最终浓度换算为ppb。

1.2 牙龈成纤维细胞培养和材料对生物活性检测

细胞培养：DMEM低糖培养液（Gibco，美国），胎牛血清FBS（HyClon，美国）；细胞活性检测：吖啶橙／碘化丙啶（AO／PI）染色；免疫荧光：一抗：Monoclonal Anti-Vinculin antibody（V9131，Sigma），二抗：Anti-Mouse IgG（whole molecule）-FITC antibody（F0257，Sigma），细胞骨架：罗丹明鬼笔环肽Rhodamine Phalloidin（Cat.＃PHDR1，Cytoskeleton），细胞核DAPI（D9542，Sigma）；细胞周期：细胞周期试剂盒（南京凯基），流式细胞仪（FC-500，贝克曼库尔特，美国）。

AO-PI染色：牙龈成纤维细胞原代培养同前［3］，AO-PI染色：HGF接种于实验组和对照组材料1 d，放入24孔板，每孔加入500μl AO／PI，室温避光15 min，荧光显微镜下计数100个HGF细胞中活细胞个数，重复7次，并计算百分比。

细胞周期：材料（2 cm×2 cm）消毒后放入6孔板，接种HGF 1×105个／孔，培养1、3、7 d，消化细胞，加ACCUTASETM细胞消化液，吹打分离材料片上的细胞收集至离心管，加入预冷70%乙醇，4℃固定1 h；离心收集细胞，细胞沉淀中加入RNaseA重悬，37℃水浴30 min；再加入400μl PI染色，4℃避光30 min；用300目尼龙网（孔径40～50μm）过滤细胞，去除细胞团块；1 h内流式细胞仪分析细胞DNA含量分布，Modfit 2.0软件分析。

免疫荧光：材料（1 cm×1 cm）消毒后放置于24孔板中，接种HGF 3.5×104个／孔，培养1 d，4%多聚甲醛室温固定15 min，，0.5%Triton X-100室温破膜5 min，1%BSA室温封闭30 min；一抗：anti-vinculin antibody，37℃孵育1 h；二抗：Anti-Mouse IgG（whole molecule）-FITC 1∶32，37℃避光30 min；细胞骨架Rhodamine Phalloidin，300μl／孔，37℃避光30 min，PBS清洗1次；DAPI染色：室温避光作用3～5 min；将材料片倒扣在滴有抗淬灭封片剂的盖玻片，荧光倒置显微镜100倍拍照观察。

1.3 材料对Pg抗菌性能检测

Pg ATCC 33277，LIVE／DEAD®BacLightTMBacterial Viability Kits（L7007 Invitrogen），BHI 3.7 g／100 ml，YEA 0.5 g／100 ml，Hemin 1 ml／100 ml，Vitk3 0.2 ml／100 ml，厌氧产气袋AnaeroPackTM-Anaero（C-11）。

材料（1 cm×1 cm）常规消毒后放置于24孔板中，A值为0.01菌液浓度接种于24孔板，在厌氧环境中培养1 d，加入STYO9／PI荧光染料避光15 min，将材料倒扣在盖玻片于倒置荧光显微镜下100倍观察拍照，重复7次，用Image J（http：／／rsb.info.nih.gov／ij／）进行荧光像素定量分析。

1.4 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件，单因素方差分析，组间统计SNK-q test进行两两比较，P＜0.05差别有统计学意义。

2 结 果

2.1 材料表面理化性能检测

扫描电镜结果（图1）显示对照组表面形貌为光滑，实验组为规则的沟槽结构，沟槽宽度为60μm，深度为10μm。原子力显微镜结果（图2）显示Ti涂层纳米颗粒较大，纳米粗糙度为：1.9 nm，TiN／Ag涂层纳米颗粒较小，纳米粗糙度为1.45 nm，实验组表面的纳米粗糙度小于对照组（图3）。亲水性结果显示对照组接触角99°，实验组接触角42°，实验组材料表面的亲水性优于对照组。表面元素含量分析显示：TiN／Ag-MG表面含有3.54%间隙氮（N），同时存在Ag 3 d，对照组材料表面不存在间隙氮（N），无Ag 3 d，实验组和对照组表面O 1s含量接近。实验组TiN／Ag-MG材料Ag释放量在第1天最高，后逐渐下降，到第3天后趋于稳态（图4）。

图1 材料表面微米级形貌（SEM）Fig 1 Microtopography of material surfaces（SEM）

图2 材料表面纳米级形貌（AFM）Fig 2 Nanotopography of material surfaces（AFM）

图3 材料表面静态接触角Fig 3 Static contact angle of different material surfaces

图4 TiN／Ag-MG材料Ag+释放量Fig 4 Silver ion release of TiN／Ag-MG

2.2 材料表面死活细胞检测

根据AO／PI原理，活细胞核呈亮绿色荧光，而死细胞核呈现橙红色（图5）。选择1 d Ag+释放量最大的时间点，可见各组细胞中死细胞和活细胞比例没有明显差异，经过计数统计，实验组和对照组组活细胞比例分别为：90.5%，91.5%，P＞0.05，差别没有统计学意义，可以推测实验组5%Ag的TiN／Ag的纳米复合膜中Ag+释放量没有加重HGF细胞的凋亡。

图5 HGFs在材料表面（AO／PI染色）Fig 5 HGFs on the material surfaces（AO／PI staining）

2.3 材料表面细胞周期推进

红色区域代表细胞增殖期S（图6），可见实验组材料表面红色区域面积明显大于对照组，即在HGF培养第1、3、7天，实验组材料表面细胞增殖周期推进比例均大于对照组，可见微沟槽表面加5%Ag的TiN／Ag的纳米复合膜有利于促进HGF的增殖。

2.4 HGF在材料表面的免疫荧光染色

细胞在材料表面免疫荧光（图7）：蓝色荧光代表细胞核，绿色荧光代表细胞Vinculin蛋白，红色荧光代表细胞骨架，可见对照组表面HGFs无规律排列，实验组材料表面HGFs顺着沟槽有规律排列，同时实验组表面生长细胞多于对照组。

2.5 Pg在材料表面死活菌黏附检测

图8绿色荧光代表活菌，橙色代表死菌，对照组材料表面绿色荧光即活菌的密度远远大于对照组，几乎连成片状菌斑，实验组材料表面绿色荧光代表的活菌黏附量明显少于对照组，且细菌状态不佳，出现较多黄色或橙色荧光，实验组材料显示了较好的抗菌性能。

3 讨 论

种植体穿龈部分与周围组织愈合的好坏关系到种植体的边缘封闭性能，该部分与组织愈合的越牢固，越能防止口腔内细菌顺着种植体边缘垂直迁移入深部，导致种植体周围炎和种植体失败。本课题组先期致力于加强种植体边缘愈合而进行种植体穿龈部分的微沟槽改性，研究证明微沟槽的存在确实有利于周围HGFs的生物活性，由于微沟槽的存在一定程度下增加了细菌可以黏附的表面积，需要在沟槽表面制作一定的抗菌涂层，研究证明Ag涂层具有良好的抗菌性能［4］，然而先期研究做了单独的Ag涂层和TiN涂层，研究发现Ag涂层抗菌性能好，但对HGFs的生物活性影响较大［5］，TiN抗菌性能一般，但对HGFs的生物活性较优［6］。因此本实验利用2种涂层的性能，对磁控溅射工艺进行改良，通过预实验制作5%Ag的TiN／Ag的纳米复合膜于微沟槽（MG，宽度60μm，深度10μm）表面，称为TiN／Ag-MG。

图6 HGFs在材料表面细胞周期图Fig 6 Cell cycle diagram of HGFs on material surfaces

图7 HGFs在材料表面免疫荧光染色Fig 7 Immunofluorescence stained of HGFs on material surfaces

图8 Pg在材料表面的死活菌检测Fig 8 Detection of dead／live Pg on the material surfaces

3.1 TiN／Ag-MG对HGFs生物活性的影响

结果显示：TiN／Ag-MG材料表面死细胞的量没有高于对照组，同时细胞周期S期所占的比例高于对照组，细胞骨架排列良好，顺着沟槽方向排列。可见新的复合涂层材料表面有利于HGF的生物活性，保持了沟槽具有的“接触诱导效应”。分析其原因与材料本身的理化性质有关，研究认为［7］材料表面的纳米粗糙度越小，越有利与细胞增殖和细胞周期的推进，复合涂层材料表面纳米颗粒小于对照组，纳米粗糙度也小于对照组，有利于HGF在材料表面细胞周期的推进和细胞的增殖。此外，研究还发现［7］材料疏水性越大，细胞在材料表面黏附铺展的越差，细胞骨架呈皱缩状态，材料表面亲水性越好，越有利于细胞黏附，细胞骨架的铺展越好，实验组材料由于沟槽形貌存在，N元素的加入［5］，材料的亲水性优于对照组，接触角为42°，HGF在其表面黏附状态优于光滑对照组，细胞骨架顺着沟槽表面铺展，显示出良好的细胞黏附状态。最后，5%Ag含量所带来的Ag离子释放量较低，没有导致明显的细胞死亡，这在AO-PI实验中得到证实，少量Ag涂层的存在没有影响细胞的生物活性，分析原因可能是由于Ag含量较低，且TiN涂层3.54%间隙氮（N）有利于细胞的生物活性，两者综合的结果还是有利于HGF的生物活性。

3.2 TiN／Ag-MG对Pg抗菌性能的影响

材料表面微沟槽形貌的改变一定程度上增加了材料的表面积，有研究认为微沟槽形貌的存在形成了保护细菌的场所，免受周围液体的冲刷［8］，实验结果显示复合纳米涂层材料表面细菌黏附的量远低于实验组，可见沟槽的存在虽然增加了细菌黏附的表面积，但其他的理化性能弥补了这一不足。首先细菌黏附在材料表面主要依靠材料与细菌的疏水作用力。材料表面疏水性越大，细菌黏附的越多越牢，微沟槽的形貌的存在极大降低了材料的疏水性，因此实验组材料表面的亲水性不利于细菌的黏附，其次，材料表面的纳米粗糙度对细菌黏附的影响不同的研究有不同观点，有研究认为细菌的黏附与纳米粗糙度的大小无关，也有研究认为纳米粗糙度增加能刺激细菌新陈代谢，促进细菌繁殖，相反的也有研究认为纳米粗糙度增加能减少细菌的黏附［9］，与传统观点越光滑的表面细菌黏附越少相反，本实验中实验组纳米粗糙度较小，实际细菌黏附减少，可能还有与复合涂层中Ag离子的释放关系很大，Ag离子一开始能够抑制细菌的黏附，进而直接影响细菌的分裂增殖，导致细菌细胞壁破裂而死亡，本实验ICP测试复合抗菌膜上方Ag离子释放从第1天到第7天始终高于1 ppb，研究证明0.1 ppb就能达到较好的抗菌作用［10］，因此微沟槽上方复合涂层的抗菌效果应该来源于材料表面的亲水性及Ag离子的释放。

综上所述，具有5%Ag的TiN／Ag复合抗菌涂层与微沟槽形貌结合（TiN／Ag-MG）材料优于单一Ag或TiN涂层，有利于牙龈成纤维细胞粘附增殖及细胞周期推进，并能引导细胞顺着沟槽生长，同时具有良好的抗菌性能，可以运用于种植体穿龈部分表面。