金蝉花核苷类成分的LC-MS定性分析与HPLC含量测定

葛 琦，万晶琼，朱益灵，王一姝，何小翠，魏 渊，欧阳臻

1江苏大学药学院；2江苏大学食品与生物工程学院，镇江 212013

金蝉花(Cordycepscicadae)为麦角菌科真菌大蝉草寄生在蝉若虫后形成的干燥复合体，与冬虫夏草的无性型同属，在民间是一种具有补益作用的中药[1]，其性寒味甘，具疏散风热、定惊镇痉等功效，在我国主要分布于江苏、浙江、安徽、云南、广东、四川等省[2]。天然冬虫夏草生长周期长，对生长环境要求较高，产量较少，价格昂贵，近年来对冬虫夏草的过度采收导致其资源枯竭。现有研究表明，金蝉花与冬虫夏草化学成分相似，主要包括多糖、核苷、甘露醇、麦角甾醇等[3]；功效相近，具有保肝护肾、抗衰老、抗肿瘤、免疫调节和镇静镇痛等[4]活性，应用前景广阔，有望开发成为冬虫夏草的代用品和药食两用新资源。

核苷类物质是虫草属的主要功效成分，具有补益、增强免疫、保护神经、抗氧化、抗癌、抗病毒和抗菌等[5]生物活性，在虫草属中发现的核苷类成分主要包括尿苷、腺嘌呤、鸟苷、虫草素、肌苷、N6-(2-羟乙基)腺苷等[6]。Sun等[7]建立HPLC-DAD法测定三种虫草发酵液与菌丝体中核苷类成分的含量。Chen等[8]采用HPLC-MS方法，从金蝉花子实体65%乙醇提取物中分离鉴定出了6种核苷类化合物。本研究采用高效液相色谱-质谱联用(high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS)方法对金蝉花水提取物中核苷类成分进行定性分析；建立高效液相色谱法(HPLC)同时对金蝉花中6种核苷类成分进行定量分析，并比较不同产地和不同部位(子实体和菌核)金蝉花中核苷类成分的含量差异，以期为金蝉花质量控制及进一步的开发利用提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1260 infinity高效液相色谱仪(安捷伦科公司)；LXQ线性离子阱质谱(赛默飞世尔科技公司)；ZF-250B超声波清洗器(上海致丰电子科技有限公司)；BSA 124S分析电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；RO-MB-10D高纯水机(杭州永洁达膜分离设备厂)。

1.2 材料

腺苷对照品(批号161204，纯度≥98%)，购自成都植标化纯生物科技有限公司；腺嘌呤对照品(批号LA170651，纯度≥98%)、尿苷对照品(批号NU20170329，纯度≥98%)、肌苷对照品(批号JI191220，纯度≥98%)、鸟苷对照品(批号LG191201，纯度≥98%)，均购自合肥博美生物科技有限公司；HPLC级甲醇、HPLC级醋酸，均购自国药集团化学试剂有限公司；娃哈哈纯净水。

14批金蝉花样品采收自浙江、江苏、安徽、湖南、湖北、四川、福建和云南等地，由江苏大学药学院欧阳臻教授鉴定为Cordycepscicadae，保存于江苏大学药学院药材管理室。样品信息见表1。

表1 金蝉花药材信息Table 1 The information of Cordyceps cicadae samples

2 方法与结果

2.1 金蝉花的HPLC-MS定性分析

2.1.1 供试品溶液的制备

精密称取金蝉花粉末(过 50 目筛) 0.20 g，于具塞锥形瓶中，加入10 mL超纯水，超声提取(300 W，40 kHz)30 min后过滤，定容至10 mL容量瓶中，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.1.2 色谱条件

Supersil AQ-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、ODS3预柱(10 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇(A)-0.2%醋酸水(B)；梯度洗脱：0～10 min为0%A，10～20 min为0%A～5%A，20～30 min为5%A～15%A，30～40 min为15%A，40～50 min为15%A～20%A；流速为0.5 mL/min，柱温为25 ℃，检测波长为260 nm，进样量为10 μL。

2.1.3 质谱检测条件

电喷雾离子源，正离子模式；鞘气流速10.5 L/min；辅助气1.5 L/min；喷雾电压4.5 kV；毛细管温度325.00 ℃；毛细管电压-30.00 V；透镜电压-120.00 V；质量扫描范围m/z50.00～500.00。

2.1.4 定性分析结果

采用正离子模式进行分子量分析。根据各色谱峰的相对分子量(m/z)、保留时间(tR)、紫外特征、分子离子峰及主要碎片峰信息，参照结合相关文献[11-17]、SciFinder和化学专业数据库等天然产物数据库收录的天然产物，对HPLC图谱进行峰归属分析，初步鉴定出13个核苷类成分为胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤、N6-(2羟乙基)腺嘌呤、脱氧胞苷、次黄嘌呤、尿苷、脱氧肌苷、脱氧尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷和N6-(2-羟乙基)腺苷。金蝉花核苷类成分的UV图和质谱总离子流图见图1，13个化合物的质谱数据见表2。

图1 金蝉花样品UV图(A)及总离子流图(B)Fig.1 UV chromatogram and LC-MS total ion current chromatogram of Cordyceps cicadae

表2 金蝉花核苷类成分HPLC-MS定性分析结果Table 2 Qualitative analysis of nucleosides by HPLC-MS

注：a经过对照品确认。

Note:aConfirmed by reference substance.

2.2 HPLC同时测定金蝉花中6种核苷类成分的含量

2.2.1 对照品溶液的制备

分别精密称取腺嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷和N6-(2-羟乙基)腺苷对照品28.0、57.2、41.8、13.6、57.1、34.1 mg，置于20 mL容量瓶中。加超纯水定容至刻度，溶解摇匀，得混合对照品储备液(腺嘌呤1.400 mg/mL、尿苷2.860 mg/mL、肌苷2.090 mg/mL、鸟苷0.680 mg/mL、腺苷2.855 mg/mL和N6-(2-羟乙基)腺苷 1.705 mg/mL)。

2.2.2 方法学考察

2.2.2.1 线性关系的考察

分别精密吸取混合对照品适量，逐级稀释成5个系列浓度的混合对照品溶液。按照2.1.2节色谱条件进行测定，在该条件下腺嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷和N6-(2-羟乙基)腺苷在样品中得到良好的分离，峰型较好。出峰时间分别为10.2、24.4、32.5、33.4、34.2和44.7 min，见图2。以腺嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷和N6-(2-羟乙基)腺苷质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，以各对照品峰面积Y为纵坐标对质量浓度X(μg/mL)进行线性回归，得出回归方程及相关系数。结果见表3，表明6个核苷类成分的线性关系良好。

2.2.2.2 仪器精密度试验

精密吸取同一混合对照品溶液10 μL，按2.1.2节色谱条件重复测定6次，记录峰面积，并计算得6个对照品的相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)，腺嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷和N6-(2-羟乙基)腺苷峰面积的RSD分别为0.89%、0.71%、0.87%、0.89%、0.88%和0.90%，表明仪器精密度良好。

图2 混合对照品(A)和金蝉花样品(B)高效液相色谱图Fig.2 HPLC of standard sample (A) and the Cordyceps cicadae sample (B) 注：2-腺嘌呤；7- 尿苷； 10-肌苷；11-鸟苷；12-腺苷；13- N6-(2-羟乙基)腺苷(N6-(2-Hydroxyethyl) Adenosine。Note:2- Adenine;7- Uridine;10- Inosine;11- Guanosine;12- Adenosine;13- N6-(2- Hydroxyethyl) adenosine.

表3 6种核苷类成分的线性方程、相关系数和线性范围、定量限和检测限Table 3 The regression equations,correlation coefficient,linear ranges,LOQ and LOD of 6 investigated nucleosides

2.2.2.3 方法精密度试验

2.2.2.3.1 日内精密度试验

取同批供试品溶液，按2.1.2节色谱条件重复测定6次，记录峰面积，并计算得峰面积相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)分别为0.19%、1.68%、1.02%、0.89%、1.12%和0.63%，表明日内精密度良好。

2.2.2.3.2 日间精密度试验

取同批供试品溶液，按2.1.2节色谱条件每日相同时间段连续进样3天，每天测定3次，记录峰面积，并计算得峰面积相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)分别为1.96%、0.49%、2.50%、1.17%、1.69%和0.66%，表明日间精密度良好。

2.2.2.4 加样回收试验

精密称取同一金蝉花样品粉末(过50目筛) 0.2 g，共6份，分别精密加入6种对照品溶液各1 mL，按照1.3.2节方法制备供试品溶液，按2.1.2节色谱条件测定，由回归方程计算样品中腺嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷和N6-(2-羟乙基)腺苷的平均回收率分别为101.20%、99.87%、97.32%、101.33%、100.03%、102.37%，RSD分别为0.29%、0.37%、0.45%、0.41%、0.47%和0.38%，表明该方法的加样回收效果较好。

2.2.2.5 重复性试验

分别精密称取同一金蝉花样品粉末(过50目筛)0.2 g，共6份，按照2.1.1节方法制备供试品溶液，按照2.1.2节色谱条件进行测定，根据回归方程计算样品中6种核苷成分的含量及RSD值。腺嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷和N6-(2-羟乙基)腺苷峰面积的RSD分别为0.20%、 0.17%、 0.26%、 0.30%、0.21%和0.17%，表明方法重复性良好。

2.2.2.6 稳定性试验

精密称取同一蝉花粉末(过50目筛)0.2 g，按照2.2.1节方法制备供试品溶液，分别在0、4、8、12、20、24 h，按照2.1.2节色谱条件进行测定，记录峰面积并计算RSD值，腺嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷和N6-(2-羟乙基)腺苷峰面积的RSD分别为0.83%、0.81%、0.50%、0.75%、0.76%和0.56%，表明供试品溶液在24 h内稳定性较好。

2.2.3 不同产地金蝉花核苷类成分含量测定

对14个不同产地的金蝉花样品，按照2.2.1方法制备供试品溶液，2.1.2色谱条件测定样品中核苷类成分。记录峰面积，根据回归方程计算样品中腺嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷和N6-(2-羟乙基)腺苷成分的含量。

由表4可知，14批金蝉花中的6个核苷类成分含量存在差异，其中安徽大别山样品的6种核苷总量最高为4 159.69 μg/g，福建三明的最低为2 987.44 μg/g。尿苷、鸟苷、腺苷和N6-(2-羟乙基)腺苷的含量在不同产地之间差异较小，而肌苷和腺嘌呤含量差异较大，云南昆明样品肌苷含量是江西九江样品的9.6倍，安徽大别山样品中腺嘌呤是福建三明样品的4.4倍。N6-(2-羟乙基)腺苷是虫草属中一种特有的核苷类成分且含量较高，在江苏句容金蝉花样品中含量达到921.91 μg/g。

表4 金蝉花中6种核苷类成分含量(μg/g，n=3)Table 4 Contents of 6 investigated nucleosides in Cordyceps cicadae(μg/g，n=3)

2.2.4 不同部位金蝉花中核苷类成分含量测定

将14个产地的金蝉花药材分别分为子实体和菌核两部分，按照2.1.1节供试品溶液制备方法，2.1.2节色谱条件进行含量测定。记录峰面积，根据回归方程计算不同产地金蝉花样品中腺嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷和N6-(2-羟乙基)腺苷成分的含量，结果见表6和图3。

对金蝉花不同部位核苷类成分含量分析，结果显示不同部位核苷类成分的含量存在明显差异，菌核中N6-(2-羟乙基)腺苷含量明显高于子实体，子实体中腺嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷含量则高于菌核，且肌苷和腺嘌呤的含量差异显著，子实体中含量分别为菌核的倍9.2和3.3倍，两个部位中尿苷含量均较高，分别占到了6种核苷类总量的32.0%和34.9%。

表6 金蝉花子实体和菌核中6种核苷类成分的含量(μg/g，n=3)Table 6 Contents of 6 investigated nucleosides in synnemata and sclerotium of Cordyceps cicadae(μg/g，n=3)

图3 金蝉花子实体和菌核中6种 核苷类成分的含量(μg/g，n=3)Fig.3 Contents of 6 investigated nucleosides in synnemata and sclerotium of Cordyceps cicadae(μg/g，n=3) 注：2-腺嘌呤；7- 尿苷； 10-肌苷；11-鸟苷；12-腺苷；13- N6-(2-羟乙基)腺苷(N6-(2-Hydroxyethyl) Adenosine。Note:2- Adenine;7- Uridine;10- Inosine;11- Guanosine;12- Adenosine;13- N6-(2- Hydroxyethyl) adenosine.

3 讨论

金蝉花水提取物HPLC-MS定性分析共鉴定出13种核苷类成分，分别为胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤、N6-(2羟乙基)腺嘌呤、脱氧胞苷、次黄嘌呤、尿苷、脱氧肌苷、脱氧尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷和N6-(2-羟乙基)腺苷，其中脱氧胞苷和脱氧肌苷为首次在金蝉花中被鉴定。

腺嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷和N6-(2-羟乙基)腺苷在金蝉花样品中含量较高，腺嘌呤能促进白细胞生长，从而改善肿瘤化疗引起的白细胞减少症及急性粒细胞减少症[14]；尿苷参与肝脏解毒物质葡萄糖醛酸的合成，提高细胞耐缺氧能力，提高机体抗体水平[15]；鸟苷对急性缺血性脑卒中具有神经保护作用，可抑制缺血性卒中后梗死周边的星形胶质反应和小胶质细胞活化[16]；腺苷广泛存在于细胞液中，在机体的中枢神经系统、心血管系统和凝血系统中发挥重要作用[17]。因此，本研究对以上6种核苷类成分建立HPLC同时测定的方法，以期为金蝉花的质量控制提供依据。

对不同产地的金蝉花样品中核苷类成分分析显示，不同产地的金蝉花样品核苷类成分含量有明显差异，安徽大别山和江苏句容的6种核苷类总量相对较高，浙江天目山、安徽宣城和福建三明相对较低；金蝉花中腺苷(614.33 μg/g)与人工冬虫夏草(607 μg/g)和野生冬虫夏草(597 μg/g)含量相当[18]，腺嘌呤、尿苷、肌苷和鸟苷也均与野生冬虫夏草含量相近。目前冬虫夏草中未检出N6-(2-羟乙基)腺苷成分，而在本研究中发现N6-(2-羟乙基)腺苷在金蝉花总含量仅次于尿苷，其均值为692.12 μg/g。文献报道，N6-(2-羟乙基)腺苷具有肾功能保护，镇痛和抗肿瘤的功效[19]，是一种核苷类功效成分。因此，认为金蝉花中核苷类成分含量丰富，亦是一种优质虫草。

不同部位的金蝉花样品中核苷类成分分析表明，子实体中核苷类成分总量高于菌核，且子实体中腺嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷和腺苷含量均较高，其中肌苷在子实体中含量为菌核的9.2倍，而菌核中N6-(2-羟乙基)腺苷含量较高。Li等[20]通过建立10批金蝉花不同部位核苷类成分的HPLC指纹图谱，分析显示子实体中核苷类总量显著高于菌核，与本研究结果基本一致。以上结果可为金蝉花质量控制提供参考及药材资源的综合开发利用提供理论支撑。