植物乳杆菌JY-22细菌素粗提物在鲢鱼鱼丸保鲜中的应用

崔天琦，杜 宏，吕欣然，郭 超，白凤翎,*，仪淑敏，丁浩宸，黄建联，励建荣

（1.渤海大学食品科学与工程学院，生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心，国家鱼糜及鱼糜制品加工技术研发专业中心，辽宁 锦州 121013；2.辽宁安井食品有限公司，辽宁 鞍山 114100）

我国是淡水鱼养殖大国，鲢鱼是四大淡水鱼之一，在水产品加工领域占有重要的地位[1]。鱼糜制品是指以鱼糜为原料，加入食盐、淀粉、辅料等进行擂溃，成浆后再成型、加热制成富有弹性的凝胶状食品的总称[2]。近年来鱼糜及其制品深受消费者的青睐，鱼糜制品因含有丰富的蛋白质、碳水化合物等营养成分，在贮藏过程中极易受微生物的污染而腐败变质，造成巨大的经济损失[3]。

芽孢杆菌在自然界分布广泛，在鱼糜制品加工过程中，热处理能诱导芽孢的萌发，在没有其他微生物与其竞争的条件下大量生长繁殖，产生毒素并引起鱼糜制品的腐败变质[4-5]。近年来，生物保鲜剂在水产品低温贮藏保鲜中颇受关注[6]。生物保鲜剂可显著抑制酶活性与微生物的生长，降低脂肪氧化和非酶褐变等对产品品质的不利因素[7]。其中植物源保鲜剂由于其成本低、来源广、食用安全等优点受到广泛应用。因此，开发新的保鲜剂控制鱼糜制品中的芽孢杆菌已经成为本领域的研究热点。李婷婷等[8]以蔬菜鱼丸为研究对象，加入不同添加量的迷迭香，结果表明迷迭香添加量为200 mg/kg时，可使鱼丸的货架期延长8～10 d。王庆丽等[9]研究壳聚糖和植酸复合生物保鲜剂对冷藏鱼丸品质的影响，结果表明0.4 g/100 mL壳聚糖和0.04 g/100 mL植酸处理能延长鱼丸货架期至14 d以上。庞彩霞等[10]以金线鱼鱼丸为研究对象，将银杏叶提取物添加到金线鱼鱼丸中，评价银杏叶提取物对金线鱼鱼丸的保鲜效果，结果表明银杏叶提取物在鱼糜制品保鲜中具有明显效果，能使产品在较长时间内保持良好的品质。

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一种新型生物保护剂[11]，主要通过生态位和营养物竞争、形成酸性环境和产生拮抗代谢产物等方式控制食品中的有害微生物，具有安全、高效和稳定等特点[12-13]。Miao Jianyin等[14]将乳酸菌Lactobacillus paracaseisubsp.toleransFX-6发酵上清液冷冻干燥并制成质量分数分别为0.15%、0.6%和1.2%的抗菌物质溶液并浸泡新鲜猪肉，在4 ℃下冷藏，结果表明经质量分数1.2%抑菌物质溶液处理的猪肉保质期可延长至12 d，并保持良好的品质特性。Weiss等[15]从烟熏鲑鱼中分离出Lb. sakeiLTH5754，在4 ℃熏制条件下接种Lb. sakeiLTH5754培养14 d可使鲑鱼中英诺克李斯特菌（L. innocua）的数量减少103.5CFU/g。缪璐欢等[16]从淡水鱼肠道中筛选出一株对芽孢杆菌具有较强拮抗活性的乳酸菌JY-22，根据生理生化特性和16S rDNA鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。

本实验在前期本实验室测得植物乳杆菌JY-22粗提物对芽孢杆菌具有较好抑制效果的基础上，通过测定鲢鱼鱼丸的感官品质、理化和细菌学等指标评价菌株JY-22粗提物对鲢鱼鱼丸的保鲜效果，以期为研发鱼丸生物保鲜剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冷冻鲢鱼鱼糜购于湖北潜江市柳伍水产食品有限公司。

供试菌株JY-22从鲫鱼肠道中分离，经生理生化鉴定和16S rRNA序列分析确定其为植物乳杆菌，于渤海大学食品科学研究院保藏。

受试菌株：地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）ACCC 11091 中国农业微生物菌种保藏管理中心；蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus） CMCC 63301 中国医学微生物菌种保藏管理中心。

食盐 锦州市大润发超市；MRS培养基、LB培养基、平板计数培养基、芽孢杆菌计数培养基、甘露醇卵黄多粘菌素（mannitol yolk polymyxin，MYP）培养基北京奥博星生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

DL-CJ-2N型超级洁净工作台 东联哈尔（北京）仪器制造有限公司；LRH系列生化培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；5804R冷冻高速离心机 德国Eppendorf公司；GI54DS立式高压蒸汽灭菌锅 致微（厦门）仪器有限公司；Vortex GENIUS 3振荡器、T25均质机 德国IKA公司；水系针筒过滤器 上海兴亚净化材料厂；BagMixer400拍打均质机 法国Interscience公司；FreeZone2.5真空冷冻干燥机 美国Labconco公司；ZB-20型斩拌机 诸城市瑞恒食品机械厂；TA.XT Plus型质构仪 英国Stable Micro Systems公司；CR-400色彩色差计 日本Minolta公司；Pro2Go便携式pH计 Mettler Toledo（香港）公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株JY-2细菌素粗提物的制备

将从鲫鱼肠道中分离获得的植物乳杆菌JY-22接种于MRS液体培养基中，37 ℃传代培养2 次后，以2%的接种量接种于100 mL MRS培养基，37 ℃培养24 h。4 ℃、8 000 r/min离心10 min，上清液用0.45 μm滤器过滤除菌，得乳酸菌无细胞上清液（cell-free supernatant，CFS）。

取乳酸菌CFS 100 mL于干净的分液漏斗中，等量乙酸乙酯分5 次加入进行萃取，加入溶剂后同一方向缓慢振荡，待静置分层明显后取上层及乳化层于无菌三角瓶中，将5 次萃取液合并，45 ℃真空旋转蒸发，直至溶液中无残留的乙酸乙酯，将残留液转存至无菌锥形瓶中，－20 ℃冷冻干燥，冷冻干燥产物即细菌素粗提物作为保鲜剂。

1.3.2 芽孢杆菌菌悬液的制备

将－80 ℃保存的菌株接种于LB培养基中37 ℃培养12 h，以培养基体积2%的接种量传代培养1 次后，用无菌生理盐水进行10 倍体积梯度稀释，制成约104CFU/mL的菌悬液，4 ℃条件下保存备用。

1.3.3 菌株JY-22细菌素粗提物对芽孢杆菌最小抑菌浓度的测定

采用双倍稀释法，用LB培养基将JY-22细菌素粗提物制成终质量浓度分别为12.0、6.0、3.0、1.5、0.75、0.25、0.375 mg/mL的溶液，各取10 mL作为实验组，以不加粗提物的LB培养基为对照组，向每支试管中加入200 μL 106CFU/mL芽孢杆菌菌悬液，37 ℃下静置培养24 h，试管中肉眼不可见浑浊的最低浓度即为最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC），每组重复测定3 次。

1.3.4 芽孢杆菌生长曲线的测定

取活化后的芽孢杆菌按2%接种量分别接种于100 mL LB培养基中，于37 ℃培养，分别于培养的不同时间点取样测OD600nm，绘制生长曲线。分组如下：A组为培养0 h后加入MRS培养基（对照组）；B组为培养0 h后加入终质量浓度为0.8 MIC的JY-22粗提物；C组和D组分别为在芽孢杆菌对数生长期加入终质量浓度为1.0 MIC和3.0 MIC的JY-22粗提物。每组重复测定3 次。

1.3.5 鲢鱼鱼丸的制作

鱼丸制作配方：冷冻鲢鱼鱼糜65%～70%（以质量分数计，下同），盐3%、水15%、淀粉10%～20%，JY-22粗提物0.6 MIC即6 mg/kg。

鱼丸制作工艺流程：鲢鱼鱼糜4 ℃解冻6 h→空斩3 min→加淀粉、水（抑菌物质溶解于水中）、盐→斩拌15 min→成型→水浴40 ℃凝胶化30 min→90 ℃水浴加热20 min→冷却

1.3.6 接种实验

在无菌操作台内，将制备好的鱼丸分别在浓度为104CFU/mL芽孢杆菌菌悬液中浸泡15 min，捞出沥干30 min，空白对照组则用生理盐水代替纯菌液，一共分为6 组，具体如下。

A1组：浸泡质量分数0.85%生理盐水（normal saline，NS），不加抑菌物质；A2组：浸泡地衣芽孢杆菌，不加抑菌物质；A3组：浸泡蜡样芽孢杆菌，不加抑菌物质。

B1组：浸泡0.85% NS，加抑菌物质；B2组：浸泡地衣芽孢杆菌，加抑菌物质；B3组：浸泡蜡样芽孢杆菌，加抑菌物质。

将鱼丸分袋真空包装后4 ℃冷藏21 d。每隔3 d取样测定菌落总数、pH值、色差、质构特性并进行感官分析。每次随机取样3 袋，结果取平均值。

1.3.7 鲢鱼鱼丸感官评价

感官评价参照文献[8]，并略作修改。感官评定由8 名专业人员组成的感官评定小组进行，鲢鱼鱼丸以色泽、气味、表观特征、总体可接受度为评价指标，各指标分为新鲜、较新鲜、一般、腐败和严重腐败5 个级别，以综合分数评定其感官质量，评分标准见表1。

表 1 鲢鱼鱼丸感官评定分值标准Table 1 Criteria for sensory evaluation of silver carp meatballs

1.3.8 鲢鱼鱼丸中菌落总数测定

按GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[17]测定菌落总数。在无菌操作台内，称取10.0 g鱼丸置于90 mL灭菌的生理盐水中，拍打匀浆120 s，室温静置20 min，经充分振荡按体积比1∶10梯度稀释，选择3 个适宜的稀释度，取1 mL稀释液与20 mL菌落计数培养基混匀，倾注平板，置于30 ℃下培养72 h，3 个重复。以灭菌的稀释液为空白对照。

1.3.9 蜡样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌总数的测定

蜡样芽孢杆菌总数的测定参考GB 4789.14—2014《食品安全国家标准 食品微生物学检验 蜡样芽胞杆菌检验》[18]。在无菌操作台内，称取10.0 g鱼丸置于90 mL灭菌的生理盐水中，拍打匀浆120 s，室温静置20 min，经充分振荡后按体积比1∶10梯度稀释，选择3 个适宜的稀释度，取0.1 mL接种于MYP琼脂平板，然后用无菌L棒涂布平板，置于30 ℃培养24 h。如前所述，将MYP培养基换成芽孢杆菌计数培养基，其余方法不变，测定地衣芽孢杆菌菌落总数。

1.3.10 pH值的测定

依照GB/T 5009.45—2003《水产品卫生标准的分析方法》[19]处理鱼丸样品，称取鱼丸10.0 g，加入新鲜煮沸后冷却的蒸馏水100 mL，均质，静置30 min后过滤，用pH计测定滤液pH值。

1.3.11 质构特性分析

测定前将鱼丸于室温放置30 min，切成直径2.5 cm、高2.5 cm的圆柱体[20]，选用质构仪的TPA模式测定其硬度、弹性等各项指标。测试参数设定为：P/50探头、测前速率2 mm/s、测试速率2 mm/s、测后速率2 mm/s、触发力5 g、压缩程度为40%，其中停留时间5 s，每组样品做3 个平行。

1.3.12 白度的测定

采用CR-400色差计测定鱼丸凝胶的亮度L*值，其值从0到100变化，0表示黑色，100表示白色；红绿度a*值表示从红到绿的值，正值代表红色程度，负值代表绿色程度；黄蓝度b*值表示从黄到蓝的值，正值表示黄色程度，负值表示蓝色程度。每组样品平行测定3 次。白度按下式计算[21]。

1.4 数据处理与分析

采用SPSS 19.0软件进行数据处理和重复测量方差分析，采用Origin 8.0软件作图。地衣芽孢杆菌对数生长期的菌体分裂，其菌量仅约为对照组的1/2，8 h后保持恒定状态；且随着菌株JY-22细菌素粗提物质量浓度的增加，OD600nm降低。在蜡样芽孢杆菌生长6 h后加1.0 MIC的抑菌物质后，因抑菌物质质量浓度较低，对蜡样芽孢杆菌抑制作用弱，但随着菌株JY-22细菌素粗提物质量浓度从1.0 MIC增加到3.0 MIC，菌体数量没有达到正常的高峰，其菌量仅为达到正常生长菌的2/3。Belgacem等[22]在致病菌Listeria ivanoviiBUG496对数生长期时加入不同浓度的肠球菌素MMZ17，发现其OD630nm保持恒定，且仅为对数生长期的1/4。

2.2 菌株JY-22细菌素粗提物对鲢鱼鱼丸贮藏过程中感官评分的影响

图 2 鲢鱼鱼丸在地衣芽孢杆菌（A）和蜡样芽孢杆菌（B）处理下感官评分变化Fig. 2 Sensory evaluation of silver carp meatballs with B. licheniformis (A)or B. cereus (B)

2 结果与分析

2.1 菌株JY-22细菌素粗提物对芽孢杆菌生长曲线的影响

图 1 菌株JY-22细菌素粗提物对地衣芽孢杆菌（A）和蜡样芽孢杆菌（B）生长曲线的影响Fig. 1 Effect of JY-22 bacteriocin on growth curve of B. licheniformis (A)and B. cereus (B)

Y-22细菌素粗提物对蜡样芽孢杆菌以及地衣芽孢杆菌的MIC均为6.0 mg/mL。从图1可以看出，在0 h和6 h加JY-22细菌素粗提物对芽孢杆菌的生长均有较好的抑制作用。与对照组相比，当加入粗提物后其生长曲线明显变化，对照组在24 h内呈正常的生长曲线，在0 h加0.8 MIC的JY-22细菌素粗提物后对芽孢杆菌生长具有明显的抑制作用，对比6 h后加入JY-22细菌素粗提物的组别与对照组的生长曲线，可发现JY-22细菌素粗提物抑制了

感官评定是通过视觉、嗅觉、触觉、味觉和听觉而感知到的产品感官特性。如图2所示，所有处理组样品均在4 ℃条件下贮藏21 d，随着贮藏时间的延长，各处理组鱼丸样品的感官品质发生不同的变化。第0天时，各组鲢鱼鱼丸的感官评分差异不明显，说明JY-22细菌素粗提物对鲢鱼鱼丸品质影响不大，在12 d内各处理组的鲢鱼鱼丸感官评分均匀下降，第15天时，经地衣芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌处理后鱼丸出现明显的感官异常，且鱼丸开始泛黄、并伴有腥臭味。而经0.6 MIC的JY-22细菌素粗提物处理后的各感官指标均在可接受的范围内，说明JY-22细菌素粗提物处理可以较好地维持鲢鱼鱼丸的感官品质。

2.3 菌株JY-22细菌素粗提物对鲢鱼鱼丸贮藏过程中菌落总数的影响

微生物的生长代谢是影响冷藏鱼糜制品腐败变质的主要原因，菌落总数可作为判定食品被污染程度的标志[23]。由图3可知，6 组样品菌落总数在4 ℃贮藏期间呈不同程度的上升趋势。在初始时，细菌菌落总数为1.0～4.0（lg（CFU/g）），浸泡生理盐水组菌落总数在第12天达到6.7（lg（CFU/g）），超过NY/T 1327—2018《绿色食品 鱼糜制品》[24]中对鱼糜制品菌落总数的规定值（4.7（lg（CFU/g）））。第6天时，经地衣芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌处理后的菌落总数高于4.7（lg（CFU/g））。第9天时，经0.6 MIC JY-22粗提物处理并接种地衣芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌的鱼丸中菌落总数分别为5.9（lg（CFU/g））和6.5（lg（CFU/g）），经菌株JY-22细菌素粗提物单独处理后菌落总数在第15 天达到5.9（lg（CFU/g））。从总体上看，添加了菌株JY-22细菌素粗提物的3 组鲢鱼鱼丸保鲜效果较好，保质期最少能延长3 d。

图 3 不同处理对鲢鱼鱼丸贮藏过程中菌落总数的影响Fig. 3 Effects of different treatments on viable cell count of silver carp meatballs during storage

2.4 菌株JY-22细菌素粗提物对鲢鱼鱼丸贮藏过程中蜡样芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌菌落总数的影响

图 4 不同处理对鲢鱼鱼丸贮藏过程中地衣芽孢杆菌（A）和蜡样芽孢杆菌（B）总数的影响Fig. 4 Effects of different treatments on total count of B. licheniformis (A)and B. cereus (B) in silver carp meatballs during storage

如图4A、B所示，鲢鱼鱼丸中地衣芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌的数量随着贮藏时间的延长而增加，但是增长速率有所差异。第21天时，添加菌株JY-22细菌素粗提物处理后比单独添加地衣芽孢杆菌组的菌落数减少了1.92（lg（CFU/g）），比单独添加蜡样芽孢杆菌数组的菌落数降低了1.00（lg（CFU/g）），说明菌株JY-22细菌素粗提物能抑制鲢鱼鱼丸中蜡样芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的生长和繁殖，从而延缓鲢鱼鱼丸的腐败变质。

2.5 菌株JY-22细菌素粗提物对鲢鱼鱼丸贮藏过程中pH值的影响

图 5 不同处理对鲢鱼鱼丸在贮藏过程中pH值的影响Fig. 5 Effects of different treatments on pH of silver carp meatballs during storage

由图5可以看出，未添加菌株JY-22细菌素粗提物处理组（对照组）的初始pH值在7.0左右，添加JY-22粗提物处理组的pH值在6.5左右，略低于相应的对照组。在整个贮藏期间，不同处理条件下样品的pH值变化趋势相同，均先稍有上升后逐渐下降，pH值上升是由于腐败微生物的生长繁殖分解鱼丸中的蛋白质进而生成了氨类等碱性化合物[25]。第12天开始，所有处理组的pH值逐渐下降，可能由于细菌代谢利用有机小分子发酵产酸[26]，且未添加菌株JY-22细菌素粗提物的处理组的pH下值降较快，说明菌株JY-22细菌素粗提物能抑制鲢鱼鱼丸的腐败变质。该结果与仪淑敏等[27]发现梅鱼鱼丸0 ℃贮藏过程中pH值的变化趋势一致。

2.6 菌株JY-22细菌素粗提物对鲢鱼鱼丸贮藏过程中质构变化的影响

由图6A可以看出，不同处理条件下的鱼丸硬度总体表现为先下降后逐渐上升的变化趋势，添加乳酸菌JY-22细菌素粗提物对鲢鱼鱼丸硬度影响不明显。接种地衣芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌的鱼丸硬度下降较快，可能是由于细菌的生长繁殖导致产酶量增加及酶活性增强，加速了蛋白质的降解，破坏了鱼丸中蛋白质网络空间结构的完整性，使得蛋白凝胶软化腐败，鱼丸硬度下降[28]。鱼丸硬度增加可能是冷藏过程中在微生物的作用下，蛋白质骨架遭到破坏，使蛋白质的保水力逐渐降低所致[29]。

由图6B可以看出，添加乳酸菌JY-22细菌素粗提物对鲢鱼鱼丸的弹性影响不明显。在第9天时，接种地衣芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌的鱼丸弹性达到最低，可能是由于微生物及蛋白酶对蛋白质的作用破坏了凝胶的空间立体网络结构，使网络结构孔隙变大甚至破裂所致。

图 6 不同处理对鲢鱼鱼丸贮藏过程中硬度（A）和弹性（B）的影响Fig. 6 Effects of different treatments on hardness (A) and springiness (B)of silver carp meatballs during storage

2.7 菌株JY-22细菌素粗提物对鲢鱼鱼丸贮藏过程中白度的影响

图 7 不同处理对鲢鱼鱼丸贮藏过程中白度的影响Fig. 7 Effects of different treatments on whiteness of silver carp meatballs during storage

鱼丸的白度能反映鱼丸的色泽，从图7可以看出，不同处理组鲢鱼鱼丸的白度总体呈现先增加后降低的趋势。添加乳酸菌JY-22细菌素粗提物会在一定程度上使鱼丸的白度降低，这可能是由于乳酸菌粗提物本身具有黄褐色，但从感官上，这种白度差异很难用肉眼分辨，因此可以认为添加JY-22细菌素粗提物对鱼丸白度影响不明显。

3 结 论

本实验将植物乳杆菌JY-22细菌素粗提物应用鲢鱼鱼丸产品保鲜，测定对鲢鱼鱼丸新鲜度等保鲜指标的影响，结果表明在4 ℃贮藏过程中，菌株JY-22细菌素粗提物处理可以较好地维持鲢鱼鱼丸的感官品质，并且能有效抑制鲢鱼鱼肉中芽孢杆菌和细菌的生长。JY-22细菌素粗提物可以较好地维持鱼丸的硬度，对弹性的影响不明显，能够保持鱼丸良好的质构特性，JY-22细菌素粗提物会在一定程度上使鱼丸的白度降低，但是颜色变化不明显，可延长鲢鱼鱼丸的货架期3 d。菌株JY-22作为生物保鲜剂可用于鲢鱼鱼丸等产品的防腐保鲜，具有一定的应用价值。