As(Ⅲ)和As(Ⅴ)在香菇栽培基质和子实体中的迁移规律

唐庆强，曹晓钢，夏林兵，陈锦丽，张凤珍，罗顺玉，王丹红*

（1.三明海关，福建 三明 365000；2.拉萨海关，西藏 拉萨 850001；3.杭州海关，浙江 杭州 310016；4.福州海关，福建 福州 350001）

香菇具有高蛋白、低脂肪以及食药兼用的特点，被联合国粮食及农业组织推荐为健康食品，经常食用能够增强人体免疫力，此外香菇还具有防癌抗癌、降低血压和胆固醇的作用[1]。为满足消费需求并且降低成本，人工栽培香菇的原料已从单纯椴木、木屑等转向棉籽壳、玉米芯、秸杆、麦麸等农林副产品，同时会加入一定量的石灰、石膏、过磷酸钙等添加剂[2]，甚至会使用到工业废料（如废纸浆、烟草茎秆、酒糟等），这些原料由于来源不同，砷的含量也明显不同。香菇的生长过程中会吸收和富集培养料中的重金属[3]，从而导致砷元素从培养料中向香菇子实体中迁移。砷的化合物形态主要包括有机砷和无机砷两大类，无机砷包括亚砷酸盐（As(III)）和砷酸盐（As(V)），有机砷包括一甲基砷酸盐（monomethylated arsenic，MMA）、二甲基砷酸盐（dimethylated arsenic，DMA）、砷甜菜碱（arsenobetaine，AsB）、砷胆碱和砷糖等[4-5]。不同形态的砷毒性差异明显，砷糖、AsB等有机砷几乎没有毒性，而无机砷的毒性却很高。国际癌症研究中心已将无机砷及其化合物确认为I级致癌物质，并将MMA和DMA列为潜在的致癌物质[6]。近年来关于香菇中检出砷等重金属元素的报道[7-12]不断增加，对于砷的形态分析[13-28]也不断增多，但对香菇中无机砷的吸收富集规律方面报道较少，更缺乏对香菇培养料中无机砷临界值的研究。

本实验在两个生长年份中向香菇培养料中添加不同含量的As(III)和As(V)标准溶液，利用高效液相色谱联用电感耦合等离子体质谱法（high performance liquid chromatography coupled with inductivity coupled plasma mass spectrometry，HPLC-ICP-MS）[29]检测香菇及其培养料中5 种形态砷含量，并研究香菇对培养料中As(III)和As(V)的吸收富集规律和临界值，以期为香菇生产质量安全控制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

As(III)、As(V)标准溶液（（999±5）μg/mL）美国Inorganic Ventures公司；MMA（C）、DMA（C2H7AsO2）、AsB（C5H11AsO2） 中国计量科学研究院；其他试剂均为国产分析纯或优级纯；实验用水符合GB/T 6682—2008《分析实验室用水规格和试验方法》中规定的一级水。

1.2 仪器与设备

Altus A-10型HPLC仪、NexION 300D型ICP-MS仪美国PerkinElmer公司；3-18K高速离心机 德国Sigma公司；VERSASTAR型酸度计 美国Thermo Scientific公司；MS3D S25型漩涡振荡仪 德国IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 香菇栽培条件及实验设计

室内温度25～26 ℃，室外为自然气温，采用高棚层架袋栽培方式。

初步实验：第一年度进行初步实验。将As(III)、As(V)标准溶液用蒸馏水稀释至合适浓度后，在培养基拌料时加入香菇培养料中并充分拌匀。设置0、0.3、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/kg 7 个添加量范围较大的实验组，每组各投入24 kg培养料，分装成12 个菌袋，7 组共84 个菌袋。

精密实验：在初步实验获得结果中，As(III)和As(V)的临界值在0.35 mg/kg附近。在此基础上，于第二年度在临界值附近进行精密实验，使用与初步实验相同的标准溶液添加方式，设置0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38 mg/kg 6 个As(III)和As(V)添加量实验组，每组各投入24 kg培养料，分装成12 个菌袋，6 组共72 个菌袋。

1.3.2 5 种形态砷和总砷含量的测定

如南宋．梁楷《李白行吟图》画唐朝大诗人李白，未画任何背景，也不讲究人体比例，只在表现人物精神上下功夫，寥寥几笔，便意溢神足，使李白洒脱飘逸的形象跃然纸上。

取部分接种栽培后第2、60、99天的培养料样品、初步实验和精密实验第一潮出菇时的香菇子实体。采用GB 5009.11—2014《食品安全国家标准 食品中总砷及无机砷的测定》[30]中方法测定香菇及培养料中总砷含量，用本课题组前期建立的HPLC-ICP-MS方法[29]测定香菇及培养料中5 种形态砷的含量，并观察记录不同添加量下各菌袋香菇的产量。称取4.0 g香菇子实体或香菇培养料，加入38 mL纯水，漩涡混匀后在70 ℃水浴中超声提取40 min，加入2 mL质量分数3%乙酸溶液沉淀蛋白，于冰箱中4 ℃静置10 min，于4 ℃高速离心机中以18 000 r/min离心5 min，取上清液过0.22 μm水系滤膜后上机测定。色谱柱：Dionex IonPac AS19（250 mm×4.0 mm，3.5 μm）阴离子交换柱；Dionex IonPac AS19（50 mm×4.0 mm，3.5 μm）阴离子保护柱；流动相：A相为10 mmol/L乙酸钠、3 mmol/L硝酸钾、2 mmol/L磷酸二氢钠、0.2 mmol/L乙二胺四乙酸铁钠，用氨水调节至pH 10.7；B相为无水乙醇；等度洗脱，A相体积分数99%；流速：1.0 mL/min；进样量：50 μL；ICP-MS功率：1 350 W；以高纯氩气为载气；泵速20 r/min；驻留时间：1 000 ms；采集质荷比m/z75；采集模式：标准模式。

1.3.3 富集系数及减产率的计算

以各添加量下香菇与培养料中As(III)或As(V)含量之比计算富集系数。以各添加量下香菇子实体的产量与未添加As(III)和As(V)时产量之比计算香菇的减产率。

1.4 数据处理

用Empower 3软件处理检测结果和数据，用Excel软件处理迁移规律数据。

2 结果与分析

2.1 香菇及培养料中5 种形态砷的HPLC-ICP-MS图谱分析

图 1 5 种形态砷标准溶液HPLC-ICP-MS图Fig. 1 HPLC-ICP-MS chromatogram of five arsenic standards

图 2 培养料样品（A）和鲜香菇样品（B）的HPLC-ICP-MS图Fig. 2 HPLC-ICP-MS chromatograms of As species in culture medium (A) and fresh Lentinus edodes fruit bodies (B)

如图1、2所示，AsB、DMA、As(III)、MMA和As(V) 5 种形态砷标准溶液得到良好分离，表明该方法能够应用于培养料和鲜香菇中。

2.2 香菇对培养料中As(III)和As(V)的富集规律

2.2.1 初步实验分析结果

表 1 香菇对培养料中As(III)和As(V)的富集规律（初步实验）Table 1 Absorption and accumulation of As(III) and As(V) from culture medium in Lentinus edodes (in the first year)

从表1可知，在没有添加任何外源性砷的培养料和香菇子实体中检出了As(III)和As(V)，这表明培养料本身就含有部分的砷元素。随着外源砷元素添加量的增加，培养料和香菇子实体中的As(III)和As(V)含量也随之升高，但添加量达到5 mg/kg以上时，所有的菌袋均无法正常生长出香菇，这表明在香菇生长过程中，培养料中外源添加的砷元素会不断向香菇子实体中迁移，而且随着外源砷元素添加量的增加，其对香菇的生长产生了抑制作用。各添加量下As(III)和As(V)的富集系数范围分别为0.36～0.84和0.82～7.53，香菇子实体中的As(III)含量均小于培养料中的含量，这表明香菇子实体对培养料中的砷元素虽有一定的吸附能力，但不是很强，这与徐丽红等[31]的研究结果相似。

在初步实验设定的添加量下，As(III)和As(V)从培养料向香菇子实体中迁移的规律可以用以下方程表示，As(III)：y＝－0.365 2x2＋0.761 1x＋0.04，R2＝0.975 9；As(V)：y＝－0.823 9x2＋2.553 8x－0.069 9，R2＝0.971 3（x、y分别为培养料和香菇子实体中的As(III)或As(V)含量）（图3）。

由于现行国家标准中未对香菇中As(III)、As(V)或无机砷的限量做出规定，只有GB 2762—2017《食品安全国家标准 食品中污染物限量》[32]规定食用菌中总砷含量不得高于0.5 mg/kg。从表1可知，当As(III)和As(V)的添加量为0.3 mg/kg时，香菇子实体中的总砷含量为0.427 mg/kg，与GB 2762—2017限量要求十分接近，据此可以估算出培养料中As(III)和As(V)的临界添加量在0.35 mg/kg附近。

图 3 香菇对培养料中As(III)（A）和As(V)（B）的迁移规律（初步实验）Fig. 3 Absorption and accumulation of As(III) (A) and As(V) (B) from culture medium in Lentinus edodes (in the first year)

2.2.2 精密实验分析结果

表 2 香菇对培养料中As(III)和As(V)的富集规律（精密实验）Table 2 Absorption and accumulation of As(III) and As(V) from culture medium in Lentinus edodes (in the second year)

根据初步实验得出的结果，为获得更准确的迁移规律临界值，于第二年度开展精密实验。从表2可以看出，所有培养料均生长出了香菇子实体，各添加量下As(III)和As(V)的富集系数范围分别为0.57～0.63和1.11～1.18，香菇中As(III)和As(V)含量之和占总砷的比例为92.41%～96.47%，表明香菇中的总砷绝大多数来源于添加的As(III)和As(V)，可进一步研究培养料中As(III)和As(V)向香菇迁移的临界值。由表2可知，当培养料中As(III)和As(V)的添加量达0.33 mg/kg时，香菇子实体中总砷的含量为0.497 mg/kg，与限量要求的0.5 mg/kg极为接近，因此，可认为0.33 mg/kg为培养料中添加As(III)和As(V)的临界值。

在精密实验的添加量范围下，As(III)和As(V)从培养料向香菇子实体中迁移的规律可以用以下方程表示，As(III)：y＝－1.138 9x2＋0.921 6x－0.004，R2＝0.973 4；As(V)：y＝－9.024 3x2－4.388 1x＋0.838 7，R2＝0.971 6（x、y分别为培养料和香菇子实体中As(III)或As(V)含量）（图4）。

图 4 香菇对培养料中As(III)（A）和As(V)（B）的迁移规律（精密实验）Fig. 4 Absorption and accumulation of As(III) (A) and As(V) (B) from culture medium in Lentinus edodes (in the second year)

2.3 培养料中As(III)和As(V)含量随时间变化情况及对香菇产量的影响

从初步实验中可以看出，培养料中外源添加的砷元素会不断向香菇子实体中迁移，对香菇的生长产生抑制作用，从而降低香菇产量，甚至使其出现绝收的情况。从表1、2中可以看出，香菇子实体对培养料中As(III)和As(V)中的富集系数并不高，特别是对于As(III)，香菇子实体中的含量均小于添加量和培养料中含量。为进一步研究培养料在不同生产阶段As(III)和As(V)含量的变化，取初期（接种后2 d）、菌丝瘤结期（接种后60 d）、转色期（接种后99 d）3 个阶段的培养料，分析其中As(III)、As(V)含量的变化。

表 3 不同时期培养料中As(III)和As(V)含量及香菇减产率Table 3 Contents of As(III) and As(V) in culture medium at different cultivation times and reduction in mushroom yield

从表3中可以看出，随着栽培时间的延长，各添加量培养料中As(III)的含量持续下降，在第60天的菌丝瘤结期时已经下降到第2天时的一半以下，到第99天时更是下降到了2%左右。结合培养料中As(III)向香菇子实体中富集系数不高的情况来看，减少的As(III)并没有完全转移到香菇子实体中去，可能是转化成了其他形态的砷，或是受香菇生长环境的影响而发生了降解，各添加量培养料中As(V)的含量随着时间的延长呈现整体增长的趋势，结合香菇子实体对培养料中As(V)的富集情况来看，培养料中的As(V)有向香菇中迁移的趋势，但迁移程度不高；因此，培养料中增加的As(V)可能来自于转化后的As(III)。

栽培2～60 d各添加量下As(III)和As(V)总量整体下降，但到90 d时整体稳定并略有上升，这表明在2～60 d时As(III)和As(V)整体上是向菌丝中迁移的，而到60 d后，菌丝富集达到饱和，As(III)继续向As(V)转换，但二者总量保持稳定。

添加As(III)和As(V)后的菌袋与未添加的菌袋相比均出现了不同程度的减产，减产率随着添加量的增加而增加。从生长情况来看，正常的香菇菌袋中的菌丝于40 d左右布满全袋，60 d菌丝开始出现瘤结并部分开始转色，到90 d左右转色完成，120 d左右菌丝瘤结完毕进入出菇阶段；而添加了As(III)和As(V)标准溶液的菌袋在各个阶段均出现了不同程度的生长缓慢和生长抑制现象，走丝、转色、瘤结的时间比正常生长的菌袋平均推迟3～10 d；而且当添加的As(III)和As(V)含量大于5 mg/kg时，香菇的生长被完全抑制，出现部分菌丝直接枯死、转色不完全和无法瘤结等情况，菌袋已无法生长出香菇。说明培养料中添加As(III)和As(V)会对菌丝的生长起到抑制作用，添加量越高影响程度越大，这可能与砷元素损伤了菌丝中的某些结构、破坏了营养物质的运输，从而抑制了菌丝对生长必需元素的吸收有关。

2.4 香菇中有机砷含量与As(III)和As(V)添加量的关系

表 4 As(III)和As(V)添加量对香菇中有机砷含量的影响Table 4 Contents of organic arsenic species in Lentinus edodes cultured with different amounts of As(III) and As(V) added

从表4可知，除MMA一直未检出外，香菇子实体中的DMA和AsB两种有机砷含量随着培养料中添加的As(III)和As(V)总量的增长而逐渐升高，均高于未添加As(III)和As(V)培养料中生长出的香菇。由于本实验仅在培养料中添加了As(III)和As(V)这两种无机砷标准溶液，因此可认为香菇子实体中增加的DMA和AsB主要来源于添加的无机砷标准溶液，这可能是因为香菇在生长过程中将部分As(III)和As(V)转化为有机砷。

3 结 论

通过向香菇培养料中添加不同含量的As(III)和As(V)标准溶液，研究香菇子实体对培养料中高毒无机砷的迁移规律。结果表明，香菇子实体对添加0.3～10 mg/kg As(III)和As(V)培养料中As(III)和As(V)的富集系数范围分别为0.36～0.84和0.82～7.53；添加0.33～0.38 mg/kg As(III)和As(V)培养料中As(III)和As(V)迁移规律方程分别为y＝－1.138 9x2＋0.921 6x－0.004和y＝－9.024 3x2－4.388 1x＋0.838 7（x、y分别为培养料和香菇子实体中的As(III)或As(V)含量/（mg/kg））。根据GB 2762—2017对香菇子实体中总砷限量不超过0.5 mg/kg的要求，培养料中添加As(III)和As(V)的临界值为0.33 mg/kg。培养料中As(III)和As(V)含量的增加会导致香菇子实体的减产甚至绝收。培养料中的As(III)含量随着栽培时间的延长逐渐减少，As(V)含量略有增加，而As(III)和As(V)的总量则保持相对稳定。香菇子实体中的AsB、DMA等有机砷含量随着As(III)和As(V)添加量的增加而升高，这可能和As(III)在香菇生长时转化为As(V)或有机砷有关。