高效液相色谱法同时测定银菊清肝解毒颗粒中绿原酸和迷迭香酸含量

肖 健，刘旺培，陈华龙 △

（1.粤北人民医院，广东 韶关 512026； 2.广东省韶关市食品药品检验所，广东 韶关 512028）

银菊清肝解毒颗粒由金银花、夏枯草、桑叶、菊花4味药材组方，具有清肝明目，疏风散热，除湿、痹，解疮毒，功效用于治疗感冒风热、目赤头痛、高血压、咽喉肿痛、疔疮肿毒等。金银花和夏枯草为主药，绿原酸和迷迭香酸分别为金银花和夏枯草的主要成分。绿原酸具有广谱抗菌、抗病毒、抗肿瘤、增强免疫及解毒抗炎作用［1-2］；迷迭香酸具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎活性和免疫抑制活性、抗血栓等作用［3-5］。目前，银菊清肝解毒颗粒质量标准中未见含量测定方法，国内已有文献记载金银花和夏枯草或其制剂中的绿原酸和迷迭香酸的含量测定方法［6-14］；2015 年版《中国药典（一部）》金银花和夏枯草质量标准已分别制订了绿原酸和迷迭香酸的含量测定方法［15］。本研究中采用高效液相色谱法同时测定银菊清肝解毒颗粒中绿原酸和迷迭香酸的含量，对处方中金银花和夏枯草以绿原酸和迷迭香酸计的含量进行研究，为更好地监控和评价银菊清肝解毒颗粒的质量提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1200型高效液相色谱仪（包括G1311A四元梯度泵，自动进样器，G1314B VWD紫外检测器，美国安捷伦公司）；XSE205型电子天平（瑞士梅特勒公司）；HT-300BQ型数控超声波清洗器（济宁恒通超声电子设备有限公司）。

1.2 试药

绿原酸对照品（批号为110753-201817，含量为96.8% ），迷迭香酸对照品（批号为 111871-201706，含量为90.5%），均由中国食品药品检定研究院提供；银菊清肝解毒颗粒（粤北人民医院自制，批号分别为171030，180620，181106）；乙腈（色谱纯，美国 TIDDI公司，批号为17090576）；磷酸（分析纯，广州化学试剂厂，批号为20171101）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：菲罗门 Luna® C18（2）100A 柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.4%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～12 min、12%A，12.1～25 min、30%A，25.1～35 min、12%A）；检测波长：330 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；进样量：20 μL。

2.2 溶液制备

混合对照品溶液：分别取绿原酸、迷迭香酸对照品适量，加50%甲醇制成每1 mL含0.106 67 mg绿原酸、0.051 4 mg迷迭香酸的混合对照品溶液。

供试品溶液：取银菊清肝解毒颗粒研细，精密称取细粉约2g，置烧杯中，加甲醇50mL，超声（功率为150W，频率为50 kHz）处理10 min，静置，上清液过滤；药渣加甲醇20 mL，超声处理10 min，静置，过滤，合并滤液，滤液置水浴中挥干，残渣加50%甲醇溶解，转移至50 mL容量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，即得。

阴性样品溶液：按处方和制备工艺要求分别制作缺金银花和缺夏枯草的阴性样品，按供试品溶液制备方法分别制备缺金银花和缺夏枯草的阴性样品溶液。

2.3 方法学考察

系统适用性试验：分别吸取供试品溶液、对照品溶液，按拟订色谱条件进样测定，对系统适用参数进行考察，绿原酸、迷迭香酸色谱峰的保留时间分别为10.14 min和22.12 min；2个色谱峰与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，绿原酸、迷迭香酸色谱峰的理论板数分别为10 963和384 181。色谱图见图1。

图1 系统适用性试验高效液相色谱图

阴性干扰试验：金银花中含有绿原酸、木犀草苷等成分，夏枯草中含有迷迭香酸、咖啡酸等成分。分别取缺金银花和缺夏枯草的阴性样品溶液，按拟订色谱条件，进样测定，记录色谱图。结果阴性样品溶液色谱图中未出现绿原酸、迷迭香酸色谱峰，表明处方中的其他成分对绿原酸、迷迭香酸的检测无干扰。色谱图见图2。

图2 阴性对照试验高效液相色谱图

线性范围考察：分别精密吸取混合对照品溶液适量，加 50% 甲醇稀释 100，50，10，5，1 倍，分别精密吸取上述溶液各20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，以质量浓度（）为横坐标，以峰面积（Y）为纵坐标，进行线性回归，绿原酸、迷迭香酸的回归方程分别为Y绿=60.568 70绿-14.109 61，r=0.999 9；Y迷=61.275 07迷+4.257 22，r=0.999 9。结果表明，绿原酸、迷迭香酸质量浓度分别在1.0667～106.6700μg/mL和 0.514 0 ～ 51.400 0 μg/mL 范围内与峰面积线性关系良好。

最低检测限考察：将混合对照品溶液逐步稀释后，分别精密量取20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，以信噪比（S/N）=3考察最低检测限。结果绿原酸、迷迭香酸的最低检测限分别为0.2133μg/mL和0.1028μg/mL。

精密度试验：取混合对照品溶液，精密量取20 μL，重复进样6次。结果绿原酸、迷迭香酸峰面积的RSD分别为0.33%和0.52%（n=6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同批样品（批号为171030）6份，依法制备供试品溶液，照含量测定项方法进样测定，分别计算含量。结果，绿原酸、迷迭香酸含量的RSD分别为1.12%和1.31%（n=6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液，置室温下，分别于0，2，4，6，10，12，24 h 时进样测定。结果绿原酸、迷迭香酸峰面积的RSD分别为 0.82% 和 1.22% （n=7），表明供试品溶液在室温下24 h内稳定性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品约1.0 g，精密称定，置50mL容量瓶中，分别加入对照品溶液适量，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，计算加样回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n=9）

2.4 样品含量测定

分别取3批样品，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，以外标法对峰面积定量，代入线性回归方程，计算绿原酸、迷迭香酸的含量。结果见表2。

表2 样品含量测定结果

3 讨论

3.1 提取方法选择

银菊清肝解毒颗粒不仅含金银花、夏枯草、桑叶、菊花4味药材，还含较多的糖和淀粉。本研究中采用甲醇作为提取溶剂，即有效除去糖、淀粉等大量杂质，又保证了目标成分绿原酸和迷迭香酸能有效溶出。残渣加50%甲醇溶解可有效去除绿原酸和迷迭香酸色谱峰的溶剂效应，使绿原酸峰和迷迭香酸峰更好地与相邻杂质分离，测量结果更准确。

3.2 流动相选择

迷迭香酸与绿原酸的极性相差较大，迷迭香酸的极性较小，当流动相中有机相比例较小时，迷迭香酸将不能被洗脱出来；当流动相中有机相比例较大时，绿原酸峰出峰太早，难与杂质分离。经过反复试验，本研究中以乙腈-0.4%磷酸溶液为流动相梯度洗脱，既保证迷迭香酸能被洗脱出来且分离度良好，又保证绿原酸能与相邻杂质分开。

3.3 小结

采用高效液相色谱法同时测定银菊清肝解毒颗粒中绿原酸和迷迭香酸的含量，简便、快速、准确、重复性好，可提高银菊清肝解毒颗粒质量标准，为其质量监控提供参考。