白及主要活性成分Militarine对斑马鱼胚胎发育的安全性评价*

陈 浩，刘 慧，郑 林，李月婷，李勇军，巩仔鹏，黄 勇，刘丽娜

（贵州医科大学·贵州省药物制剂重点实验室/药用植物功效与利用国家重点实验室·民族药与中药开发应用教育部工程研究中心，贵州 贵阳 550004）

白及为兰科植物白及Bletilla striata（Thunb.）Reiehb.f.的干燥块茎，又名连及草、紫兰等，最早见于《神农本草经》，1963年后收藏于各个版本的《中药药典》，野生品主产于贵州、四川等地［1］。白及具有收敛止血、消肿生肌之功效，临床主治咯血、吐血、肺结核咳血、外伤出血、溃疡疼痛、汤火灼伤、皮肤皲裂和疮疡肿毒等，疗效显著［2］。Militarine为白及中含量较高的活性成分，在白及药材中的含量为 1.45% ～ 3.32%［3］。Mili-tarine能改善慢性脑缺血大鼠的认知功能障碍，减轻脑白质缺血性损伤，舒张血管［4］。模式生物斑马鱼近年来成为药物评价和毒性筛选的首选模型［5-6］。作为一种脊椎动物模型，斑马鱼与人类基因相似度高达87%［7-8］，且具有完整的组织器官，其胚胎及幼鱼对大多数药物的反应与人类临床反应相似［9-10］。斑马鱼胚胎在母体外发育，发育时间短，数量大，早期胚胎透明，可直接在显微镜下观察各组织脏器的形态变化及血液流动情况，能极大地弥补体内试验与体外试验之间的间隙［11］。本研究中选择以斑马鱼胚胎为模型，研究白及主要活性成分Militarine对斑马鱼胚胎发育的毒性作用，为Militarine的创新药物研发、临床安全用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

仪器：奥林巴斯CX41RF型电子显微镜（奥林巴斯株式会社）；DH6000BⅡ型电热恒温培养箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；AE240电子天平（十万分之一，梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；超纯水机（四川沃特尔科技发展有限公司）；超声波清洗器（功率为250W，频率为27～34 kHz，北京医疗设备二厂）；微量移液器（德国Eppendorf股份公司）。

试药与动物：Militarine对照品（批号为ps171128-04，含量≥98%，成都普思生物科技股份有限公司）；德国Tubingen野生型斑马鱼胚胎，由贵州医科大学基础医学院斑马鱼平台提供。

1.2 方法

1.2.1 溶液制备

Militarine贮备液：称取Militarine适量，溶于斑马鱼培养液（0.06 g/L海盐、亚甲基蓝）中，超声溶解，配成5 g/L的贮备液，置4℃冰箱中储存。

Militarine样品溶液：根据预试验结果，用培养液将贮备液稀释至 0.025，0.050，0.100，0.200，0.400，0.800，1.600，3.200 g/L，作为 Militarine溶液组。

Militarine样品溶液处理斑马鱼胚胎：除去未受精卵、粪便、死胎等杂物，置28℃恒温培养箱中孵育至受精后6 h，选取正常发育的胚胎，转入含有2.5 mL不同质量浓度（0.025，0.050，0.100，0.200，0.400，0.800，1.600，3.200 g/L）的 Militarine 溶液（12 孔板），每孔分别放入24枚受精卵，每个质量浓度设置3个平行组且设空白对照组。将挑选好的胚胎放入28℃恒温培养箱中培养，每隔24 h更换1次溶液，试验过程中应及时将死亡的胚胎挑出，以防对其余胚胎产生影响。

1.2.2 检测指标

Militarine对斑马鱼胚胎发育的影响：以斑马鱼胚胎培养液中发育的胚胎为空白对照组，通过电子显微镜分别于 24，48，72，96，144 受精后小时（hpf）时间点观察各胚胎的形态变化与发育情况，并详细记录，统计不同时间终点的死亡数、畸形数，并拍照记录状态。

斑马鱼胚胎 48 hpf心率［12］：记录 48 hpf胚胎 10 s内心率，每一质量浓度下随机取6枚胚胎进行统计。

斑马鱼胚胎孵化率［12］：分别选择 48，72，96 hpf统计胚胎的孵化率。统计应用Militarine后斑马鱼胚胎的孵化率。孵化率（%）=每孔已孵化胚胎/每孔总胚胎个数×100%。

斑马鱼死亡率和畸形率［13］：分别于 72，96，144 hpf时统计胚胎的畸形和死亡情况。畸形率（%）=（畸形数+死亡数）/胚胎总数×100%，死亡率（% ）=死亡数/胚胎总数×100%。

1.3 统计学处理

采用SPSS 23.0统计学软件进行数据分析。试验结果用表示，组间采用单因素方差分析比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对斑马鱼胚胎发育的影响

6 hpf开始用含不同质量浓度的Militarine溶液孵育斑马鱼胚胎后，观察了24～144 hpf期间5个时间点不同质量浓度Militarine溶液组及空白对照组斑马鱼胚胎不同发育阶段的形态变化。Militarine各组斑马鱼胚胎出现不同程度的畸形。同一时间点，剂量越大畸形情况越严重；同一浓度下，随着时间的延长畸形情况越严重。畸形主要表现为心包囊水肿、尾部和脊柱弯曲、卵黄囊水肿及色素沉积、头部和眼部发育不良。Militarine对斑马鱼胚胎72 hpf形态发育的影响见图1。

图1 Militarine对斑马鱼胚胎72 hpf形态发育的影响

2.2 对斑马鱼胚胎检测指标的影响

结果见表1。随着溶液浓度的增加，斑马鱼胚胎的尾部自主抽动次数越少，在Militarine质量浓度为3.2 g/L组中，斑马鱼胚胎未出现尾部自主抽动情况。随着质量浓度的增加，斑马鱼胚胎的心率变缓。

表1 Militarine对斑马鱼胚胎检测指标的影响（ ± s，n=6）

表1 Militarine对斑马鱼胚胎检测指标的影响（ ± s，n=6）

注：与空白对照组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01。表 2同。

质量浓度（g/L）0（空白对照组）0.025 0.050 0.100 0.200 0.400 0.800 1.600 3.200 24 hpf尾部自主抽动次数（次/分）14.67±1.21 14.00 ±0.89 13.17±1.17 12.33 ±0.82 11.00 ±1.41*9.50±0.55**9.17 ±1.17**5.67±1.03**0.00±0.00**48 hpf心率（次 /10 s）13.67±0.52 12.67 ±1.03 12.00±1.41 9.17 ±0.75**8.67 ±0.52**8.00±0.89**7.67 ±1.03**7.33±0.82**5.67±1.03**48 hpf 5.56±2.44 9.72 ±2.41 13.89±2.41*26.39±6.37**34.72 ±4.81**26.39±2.41**22.22±6.37**12.50±4.17 6.94±2.40孵化率（%）72 hpf 62.50±4.17 63.89 ±8.67 72.22±6.37*76.39 ±2.41**80.56 ±6.36**75.00±4.17*69.44 ±6.36 61.11±4.81 51.39±2.41*96 hpf 98.61±2.41 97.22 ±2.41 94.44±6.36 97.22±2.41 91.67 ±4.17 83.33±8.33**79.17±4.17**75.00±8.33**65.28±6.36**

2.3 对斑马鱼胚胎不同时间段死亡率和畸形率的影响结果见表2。

3 讨论

斑马鱼早期胚胎透明，在显微镜下可清晰观察整体动物多个主要器官的发育情况［14］，具备整体评价药效学及药动学、代谢活性等优势，斑马鱼生物模型便于检测分析中药毒性［15］。

本研究结果表明，在24 hpf前，Militarine溶液组胚胎发育在形态上与空白对照组比较无明显差异，但随着时间的推移，除质量浓度为 0.025，0.050，0.100 g/L 外，其他质量浓度组胚胎的尾部自主抽动次数与空白对照组比较有明显差异（P＜0.05）。自主抽动是斑马鱼胚胎最初的运动特征，主要由脊柱运动神经元支配肌肉系统而发生［16］。随着质量浓度的增加，斑马鱼胚胎的尾部自主抽动次数越少。在Militarine浓度3.2 g/L组中，斑马鱼胚胎未出现尾部自主抽动情况，表明在24 hpf时Militarine对斑马鱼胚胎脊柱神经系统或运动系统造成了一定影响。

心脏是胚胎发育过程中最早发育并发挥功能的器官，心率是体现心脏功能的一个重要指标，胚胎发育48 h后心率基本趋于稳定［17-18］。故选择在此时测定其心率。结果表明，Militarine能使斑马鱼胚胎的心率明显降低，且质量浓度越高，心率降低越明显，说明高质量浓度的Militarine溶液会对胚胎发育产生心脏毒性。

表2 Militarine对斑马鱼胚胎死亡率和畸形率的影响（ ± s，%，n=3）

表2 Militarine对斑马鱼胚胎死亡率和畸形率的影响（ ± s，%，n=3）

质量浓度（g/L）0（空白对照组）0.025 0.050 0.100 0.200 0.400 0.800 1.600 3.200死亡率 畸形率72 hpf 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 5.56±2.40**9.72±2.41**23.64±4.81**37.50±4.17**63.89±4.81**73.61±8.76**96 hpf 0.00±0.00 0.00±0.00 8.33±4.17**13.89±2.41**25.00±4.17**38.89±4.81**59.72±2.41**83.22±7.22**100.00±0.00**144 hpf 0.00±0.00 0.00±0.00 11.11±2.41**16.67±4.17**30.56±2.41**65.28±4.81**98.61±2.41**100.00±0.00**100.00±0.00**72 hpf 0.00±0.00 6.94±2.40**13.89±2.41**26.42±4.84**48.61±2.41**59.72±6.37**100.00±0.00**100.00±0.00**100.00±0.00**96 hpf 0.00±0.00 34.72±2.41**50.00±4.17**63.89±6.36**77.78±2.41**81.94±6.36**100.00±0.00**100.00±0.00**100.00±0.00**144 hpf 0.00±0.00 52.78±6.37**75.00±4.17**88.89±2.41**100.00±0.00**100.00±0.00**100.00±0.00**100.00±0.00**100.00±0.00**

孵化率是斑马鱼胚胎毒性评价的重要指标。本研究结果显示，48 hpf时，Militarine各质量浓度组能促进胚胎出膜；72 hpf时，0.050，0.100，0.200，0.400 g/L 质量浓度能促进斑马鱼胚胎出膜，3.2 g/L质量浓度能抑制斑马鱼胚胎出膜；96 hpf时，0.400，0.800，1.600，3.200 g/L质量浓度能抑制斑马鱼胚胎出膜。给药后，斑马鱼胚胎中质量浓度出膜较快可能是由于胚胎神经受到药物的影响，产生兴奋行为，较空白对照组出膜快，而高质量浓度由于浓度过高，神经由兴奋变为抑制，因而出现出膜延迟或不出膜现象［19］。

结果表明，在同一时间点，随着给药质量浓度的增加（除 0.025 g/L 和 0.05 g/L 在 72 hpf时未出现死亡），斑马鱼胚胎的死亡率和畸形率逐渐增加，与空白对照组比较有显著差异（P＜0.01）；在同一质量浓度，随着给药时间的延长（除0.025 g/L未出现死亡），斑马鱼胚胎的死亡率和畸形率逐渐增加，与空白对照组比较具有显著差异（P＜0.01）。1.600 g/L，3.200 g/L 的斑马鱼胚胎在72 hpf出现心包水肿、色素沉积，且随着时间的延长和浓度的增大，胚胎死亡率和畸形率呈现递增趋势，表明死亡和畸形情况与给药时间和给药浓度均相关。

综上所述，Militarine溶液的浓度对斑马鱼胚胎发育的毒性存在量效关系，其作用时间长短对胚胎发育毒性也存在明显的剂量效应，高浓度（1.600 g/L和3.200 g/L）Militarine溶液对斑马鱼胚胎发育影响显著，主要表现在使神经、系统损害、心脏组织发育异常，生理上的运动功能丧失。虽然斑马鱼胚胎及幼鱼对大多数药物反应与人类临床反应相似［20］，通过该试验能为以后临床用药提供初步的数据参考，后续研究中将会用不同种属的动物对Militarine的安全性进行全面的系统研究。