补肺活血胶囊高效液相色谱特征指纹图谱研究及多成分含量测定

舒 婷，黄湘杰

（湖南省湘乡市人民医院药剂科，湖南 湘潭 411400）

补肺活血胶囊是由黄芪、赤芍、补骨脂3味药材经水提醇沉浓缩而制得，具有益气活血、补肺固肾之功效，对咳嗽气促，或咳喘胸闷，心悸气短，肢冷乏力，腰膝酸软，口唇紫绀有一定疗效［1］。其中，黄芪具有补气升阳、固表止汗、利水消肿之功效，含有黄酮类、皂苷类及多糖等化学成分［2-3］；芍药占总处方量的40%，具有止痛、抗炎、免疫调节的药理作用，主要活性成分为萜类、苷类、黄酮类［4-5］；补骨脂具有抗炎、补肾益阳及抗衰老功效，特征成分补骨脂素和异补骨脂素等呋喃香豆素类在高效液相色谱（HPLC）图中可清晰分辨［6-7］。目前，药典中对补肺活血胶囊的定量要求集中在黄芪甲苷和芍药苷定量分析方面，并未涉及补骨脂，根据中医理论，中药的药效是多成分联合发挥作用，目前已广泛运用到中药质量分析和评价领域的中药指纹图谱，能全面整体地反映其所含化学成分的种类及数量，具有整体性、稳定性和准确性［8-10］。2015年版《中国药典》新收录了9个中成药制剂的指纹图谱和28个特征指纹图谱，以加强对中药质量的整体控制［11］。为了更全面地监控补肺活血胶囊的质量，完善其质量评价体系，本研究中采用HPLC法建立了补肺活血胶囊的指纹图谱，并对其中的毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、芍药苷、补骨脂素、异补骨脂素5种主要活性成分的含量进行测定，为补肺活血胶囊的质量评价和鉴定提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司，包括G1311A四元梯度泵，G1329A自动进样器，G1314B-DAD检测器，G1316A柱温箱，Agilent-Chemistation数据处理系统）；AUW-220D型电子天平（d=0.01mg，日本岛津公司）；KQ-250DB 型数控超声波清洗器（昆山超声波仪器有限公司，功率为500W）；Milli-QIntegral5型超纯水一体化系统（德国默克密理博公司）；《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012A版本）。

1.2 试药

毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品（Calycosin7-O-β-D-Glucopyranoside，批号为 111920-201606，纯度为97.6% ），芒 柄 花 素 对 照 品 （Formononetin，批 号 为111703-201504，纯 度 为 99.9% ），芍 药 苷 对 照 品（Paeoniflorin，批号为 110736-201842，纯度为 97.4%），补骨脂素对照品（Psoralen，批号为110739-201637，纯度为99.7%），异补骨脂素对照品（Isopsoralen，批号为110738-201715，纯度为99.5%），均购自中国食品药品检定研究院；乙腈（批号为AS18419），甲醇（批号为MS192707），均为色谱纯，购自 Tedia company；磷酸（分析纯，批号为20181225，永华化学科技有限公司）；补肺活血胶囊（市售，广东雷允上药业有限公司，批号分别为20180113，20180226，20180320，20180414，20180517，20180628，20180905，20181011，20181118，编号 S1 ～S9；广东远大药业有限公司，批号分别为180307，180513，180622，180916，编号 S10 ～S14）。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

混合对照品溶液：精密称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、芍药苷、补骨脂素、异补骨脂素对照品各适量，用甲醇超声处理溶解，制得质量浓度分别为2.0042，2.428 3，5.534 7，2.361 8，1.952 6 g/L 的混合对照品贮备液，分别精密量取 0.5，1，2，3，4，5，6 mL 置 50 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制得系列对照品溶液，室温避光保存，备用。

供试品溶液：取装量差异项下的本品，研细，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定质量，密塞，超声处理（功率为450 W，频率为40 kHz）45 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2 色谱条件［12-14］

色谱柱：Agilent SB-C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.7% 磷酸溶液（B），梯度洗脱（按表 1）；流速：0.90 mL/min；柱温：35 ℃ ；进样量：10 μL。在此色谱条件下，各组分色谱峰对称因子为1.01 ～1.04，理论板数均大于 7 800。

表1 梯度洗脱程序与检测波长

2.3 HPLC指纹图谱的建立

精密度试验：取样品（批号为20181118），依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件连续进样6次，测定，记录色谱图，以芍药苷为参比峰，结果各共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD分别为0.56%和0.32%（n=6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取样品（批号为201811189），依法制备供试品溶液6份，在拟订色谱条件下分析，记录色谱图，以芍药苷为参比峰，结果各共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD分别为 1.17%和 0.49%（n=6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取样品（批号为20181118），依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件，分别于 0，5，10，15，20，24h时进样测定，记录色谱图，以芍药苷为参比峰，结果各共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD分别为1.05%和0.51%（n=5），表明供试品溶液在24 h内稳定。

指纹图谱的建立及相似度评价：按重复性试验项下方法制备14批供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，记录色谱图。将14份指纹图谱依次导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件，以样品（编号为S1）的指纹图谱作为参照图谱，设定时间窗宽度为0.3，采用多点校正全谱匹配，生成指纹图谱共有模式，并计算各谱与共有模式的相似度。结果在14批样品指纹图谱中，共得到18个共有峰，14批样品指纹图谱的相似度分别为0.986，0.993，0.991，0.994，0.989，0.987，0.989，0.987，0.986，0.992，0.998，0.997，0.996，0.995，均大于0.98，详见图 1。

图1 补肺活血胶囊高效液相色谱指纹图谱

部分共有峰指认及相对峰面积计算：将指纹图谱与混合对照品溶液色谱图进行比对，以保留时间为评价指标，指认出共有峰中5种化合物，其中芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、补骨脂素和异补骨脂素的保留时间平均值分别为 27.95，33.02，35.11，43.89，45.51min。其中，芍药苷峰信号强度较大，分离度良好，位置居中，选为参考峰，计算各共有峰的相对峰面积。由图1可知，按指纹图谱验证要求优化色谱条件，得出18个成分，并进行相似度计算，后期试验仅研究了5个主要有效成分，其余成分未作研究。结果见表2。

2.4 补肺活血胶囊中5个组分含量测定

线性关系考察及检测限和定量限检测：按拟订色谱条件进样分析，分别精密量取系列质量浓度的混合对照品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图。以峰面积为纵坐标（Y）、进样量为横坐标（）进行线性回归，绘制各组分标准曲线，计算回归方程和相关系数。结果表明，毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、芍药苷、补骨脂素、异补骨脂素进样量在试验范围内与峰面积线性关系良好。分别取峰面积信噪比为10（S/N=10）和3（S/N=3）时的混合对照品溶液考察定量限（LOQ）和检测限（LOD）。结果见表 3。

精密度试验：取同一批（批号为20181118）样品，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、芍药苷、补骨脂素、异补骨脂素峰面积的RSD分别为0.44%，0.51%，0.47%，0.36%，0.73%（n=6），表明仪器精密度良好。

表2 14批样品HPLC图谱共有峰的相对保留时间和相对峰面积

表3 补肺活血胶囊中5个组分的回归方程、LOD和LOQ

稳定性试验：取同一批（批号为20181118）样品，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件，分别于0，3，6，9，12，18，24 h时进样测定，记录峰面积。结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、芍药苷、补骨脂素、异补骨脂素峰面积的RSD分别为 0.91% ，1.10% ，1.32% ，0.34% ，1.23%（n=7），表明供试品溶液在24 h内稳定。

重复性试验：取同一批（批号为20181118）样品，依法制备供试品溶液6份，按拟订色谱条件测定，记录峰面积。结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、芍药苷、补骨脂素、异补骨脂素的平均含量分别为 3.272 5，3.051 1，10.212 0，2.785 6，2.223 6 mg/g，RSD分别为 0.85% ，1.01% ，0.66%，0.74%，0.92%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取同一批（批号为20181118）样品，6份，每份0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，依法制备供试品溶液，精密加入毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、芍药苷、补骨脂素、异补骨脂素混合对照品贮备液溶液（质量浓度分别为 2.004 2，2.428 3，5.534 7，2.361 8，1.952 6 g/L）0.3 mL，依法制备供试品溶液，摇匀，滤过，按拟订色谱条件测定，记录峰面积，计算各组分加样回收率，结果见表4。

表4 加样回收试验结果（n=6）

样品含量测定：取编号为S1～S14的样品，按2.2项下方法制备供试品溶液，按拟订色谱条件测定，记录色谱图，按外标法分别计算各成分的含量，结果见表5。

2.5 聚类分析［15-16］

将14批样品中18个共有峰的相对峰面积数据导入SPSS 22.0软件，采用离差平方和法（Ward法），以欧氏距离平方为测度，采用系统聚类分析法进行模式识别分析，结果见图2。根据聚类分析树状图，当类间距介于10～25 时，14 批样品可聚为两大类，S7，S5，S8，S1，S6，S9，S2，S4，S3 为第 1 类，S12，S11，S10，S13，S14 为第 2类。第1类均为广东雷允上药业有限公司产品，第2类均为广东远大药业有限公司产品，说明同一厂家的产品质量具有较高的稳定性。

表5 补肺活血胶囊中5组分含量测定结果（mg/g，n=3）

图2 14批补肺活血胶囊聚类分析树状图

3 讨论

3.1 色谱条件和提取方式优化

考察流动相时，选用了甲醇-水系统、甲醇-磷酸系统、乙腈-水系统、乙腈-磷酸系统，发现在流动相中加入一定比例的酸有助于改善峰形；又比较了乙腈-磷酸溶液（0.1% ，0.3% ，0.5% ，0.7% ）进行梯度洗脱。结果表明，以乙腈-0.7%磷酸溶液为流动相得到HPLC色图谱峰数量最多且分离度好。试验中利用DAD在190～400 nm波长范围内扫描，为使毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、芍药苷、补骨脂素、异补骨脂素各成分均在其最大吸收波长下进行同时测定，采用不同检测波长不同时段切换：238 nm波长处检测芍药苷、补骨脂素、异补骨脂素，254 nm波长处检测毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素；曾比较不同提取溶剂（甲醇、80%甲醇、50%甲醇）、不同提取方式（浸渍过夜、加热回流、超声提取）、不同提取时间（30，35，40，45 min）的提取效果，以甲醇溶液超声提取45 min时，各待测成分提取率高。

3.2 含量测定结果分析

将14批样品中的5种有效成分含量结果输入SPSS 22.0统计学软件的“描述性分析”，毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、芍药苷、补骨脂素、异补骨脂素含量标准差值分别为 0.016 8，0.028 7，0.089 1，0.025 1，0.008 4，平均值分别为 3.281 2，3.056 9，10.218 0，2.777 6，2.223 8，且均在均值 95% 置信区间上下限区域内，与平均值无明显差异。即14批样品中5种成分含量无异常值，说明补肺活血胶囊产品性质稳定。

本研究中建立的补肺活血胶囊的HPLC指纹图谱，实现了对其质量的全面综合评价和分析；建立的HPLC法同时测定其中5种成分含量的方法简单有效、结果准确、精密度好，可用于补肺活血胶囊中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、芍药苷、补骨脂素、异补骨脂素含量的同时测定，可为补肺活血胶囊客观、系统的质量评价提供参考。