补中益气丸（水丸）的中药指纹图谱研究

张永昕 ，李莎恩 ，段付军 ，张 莹 ，陈 隽 ，王振华

（1.中国人民解放军南部战区空军医院，广东 广州 510602； 2.广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006）

补中益气丸由金元时期李东垣所创，载于《脾胃论》，由黄芪、党参、白术、甘草、当归、陈皮、升麻和柴胡组方［1］。具有补中益气、调理脾胃、升阳举陷的功效，是临床常用的益气健脾代表方，适宜于脾胃虚弱、中气下陷所引起的疾病。目前，市场上补中益气丸产品较多，由于药味较多，缺乏统一、规范的制作标准，造成质量参差不齐，又缺乏统一的质量评价标准。中药指纹图谱是一种可量化的鉴定手段，通过对指纹图谱的整体特征与已知数据进行比对，可对其作出宏观分析，对辨别真伪有指导意义［2-6］。本研究中利用化学计量学知识，选取12批不同批次的补中益气丸（水丸），考察其6种主要指标成分，利用高效液相色谱（HPLC）法对这些成分的指纹图谱信息进行采集和分析，建立一种能科学、准确地控制补中益气丸（水丸）质量的研究方法，为其品质的优劣评定及质量控制提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

仪器：LPG-3400SDN型液相系统（Thermo公司）；U300型高效液相色谱仪（赛默飞公司）；BSA224S型分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；U系列纯水机（Aquapro公司）；JJ1000型电子天平（常熟市双杰测试仪器厂）；FQ3200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HH-SⅡ-N14B型电热恒温水溶锅（北京精科华瑞仪器有限公司）；DHG-9145A型电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；FZ-230型家用万能粉碎机（温岭市牧屿百乐机床厂）。

试药：补中益气丸（水丸，北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂，规格为每袋 6 g，批号分别为13061479，14080835，14082972，15071479，15080026，15080047，15081358，15082109，15082417，15082679，15111047，16080747，编号为 S1～S12）；橙皮苷、甘草苷、阿魏酸、异阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草酸铵对照品（成都瑞芬思生物科技有限公司，纯度均为98.00% ，批号分别为 C-006-150318-4，G-009-141110，A-002-140727，Y-044-140801，M-020-150130-1，G-003-150314）；乙腈、甲醇（色谱纯，美国霍尼韦尔国际公司）；水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

取干燥至恒重的毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、甘草苷、异阿魏酸、橙皮苷、甘草酸铵对照品，以甲醇溶液分别配制成质量浓度分别为 0.728 6，1.000 0，1.040 0，1.040 0，0.400 0，1.000 0 g/L 的对照品贮备液。分别精密量取上述对照品贮备液 50，15，150，150，3 000，570μL，置10mL容量瓶中混匀，加甲醇溶液并定容，得混合对照品溶液。称取充分研磨后的粉末状各批样品2.00g，加100mL 100%甲醇溶液，在具塞锥形瓶中充分混匀，准确称定，记录各样品质量，超声（功率为250 W，频率为40 kHz）30min，前后进行2次，放冷，称定质量，补足减失的质量，摇匀，经0.22μm微孔滤膜滤过，将续滤液转移至100mL容量瓶中，定容，充分摇匀，得供试品溶液。根据处方量及其生产工艺，分别取去除陈皮、当归和升麻、甘草、黄芪的4组药品约4 g，精密称定，按供试品溶液制备方法，分别制得橙皮苷、阿魏酸和异阿魏酸、甘草苷和甘草酸铵、毛蕊异黄酮葡萄糖苷的4组阴性对照品溶液。

2.2 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱：Diamosil C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-3%乙腈的0.1%磷酸盐水溶液（B），梯度洗脱（见表 1）；流速：0.8mL/min；检测波长：270nm，柱温：30℃；进样量：10μL。在此色谱条件下的色谱图见图1。

表1 流动相梯度洗脱程序

图1 系统适用性试验高效液相色谱图

2.3 方法学考察

专属性试验：取混合对照品溶液、供试品溶液和各阴性对照品溶液，注入高效液相色谱仪检测，进样量为10 μL，结果各成分阴性对照品溶液相应保留时间处无显著吸收峰，表明专属性良好，色谱图见图2。

图2 专属性试验高效液相色谱图

线性关系考察：精密吸取2.1项下混合对照品溶液各 3，5，8，10，14，17，20 μL，按拟订色谱条件进样测定。结果见表2。

精密度试验：取样品（批号为15080026）适量，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件依次进样测定6次，每次进样10 μL，以橙皮苷为参照峰，指定其峰值为1.000 0，记录6种指标成分的相对峰面积。结果的RSD分别为 0.682 2% ，2.026 0% ，1.146 0% ，0.170 5% ，0%，1.284 7%（n=6），表明仪器精密度良好。

图3 12批样品的高效液相色谱叠加指纹图谱

表2 6种成分线性范围及线性回归方程（n=7）

稳定性试验：取同一批（批号为15080026）样品，依法制备供试品溶液，分别于室温下放置 0，4，8，12，18，24 h时按拟订色谱条件进样测定，每次进样10 μL，以橙皮苷为参照峰，指定其峰值为1.000 0，记录6种指标成分的相对峰面积，结果的RSD分别为0.920 0%，2.071 5% ，2.637 2% ，1.823 6% ，0% ，0.952 5% ，表明供试品溶液在室温下放置24 h内稳定。

重复性试验：精密称取样品（批号为15080026）2.0g，共5份，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件依次进样测定6次，每次进样10 μL，以橙皮苷为参照峰，指定其峰值为1.0000，记录6种指标成分的相对峰面积，结果的RSD在0～0.990 1%之间，表明该方法重复性良好。

2.4 指纹图谱生成与共有峰的相关性和相似度分析

HPLC指纹图谱的生成：取12批样品，依法进行处理及提取，选取10 μL供试品溶液，按优化的色谱条件进样检测。采用中药指纹图谱相似度软件2012年版《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》，导入数据，分析得到相同厂家不同批次样品的指纹图谱匹配图。详见图3。

共有峰确证及相关性分析：采用上述方法分别处理12批次样品，得到相应的指纹图谱，作为其指纹图谱共有模式，并依据供试品溶液检测图谱中的检测结果，标定出19个峰形较好、稳定出现的共有峰，成功构建该批次补中益气丸（水丸）的指纹图谱共有模式。详见图4。

图4 12批补中益气丸（水丸）指纹图谱的共有模式图谱

指纹图谱参照峰选择：在对照指纹图谱及供试品溶液检测图谱中，各色谱图记录有100多个峰，由于各样品间的对比和描述较困难，选择图4中7号峰（峰面积较大、出峰时间适中且稳定），经对照，鉴定为橙皮苷，故选为参照峰。

相对保留时间（RRT）和相对峰面积（RPA）：19个共有峰中，以7号峰为参照，其保留时间和峰面积均为1.000 0，计算各共有峰的RRT及 RPA，结果见表3和表4。各共有峰相对保留时间的RSD均小于1.32%，相对峰面积的RSD均小于4.98%，表明12批样品差异较小。

表3 12批补中益气丸（水丸）特征图谱共有峰的相对保留时间

2.5 特征指纹图谱相似度分析

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统研究版（2004 A）软件，分别以12批样品的HPLC指纹图谱作对照，对其整体相似度进行评价，以橙皮苷为参照峰，其保留时间和峰面积均为1.000，计算其他共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，12批样品的相似度分 别 为 0.960，0.981，0.977，0.960，0.950，0.977，0.977，0.977，0.951，0.978，0.968，0.963，相似度平均值为0.968，12批补中益气丸（水丸）的指纹图谱相似度均在0.95以上，说明补中益气丸（水丸）各批次间差异较小，质量稳定性较好。

3 讨论

3.1 色谱条件优选

检测波长选择：补中益气丸中有效的化学成分较多，主要成分为生物碱类、酚类、挥发油类，中药中大部分吸收波长为254 nm，其他黄酮有机酸吸收波长多为230～360 nm，发现在 230，250，270，285 nm 波长下，各成分的吸收强度差异较大，经比对，在270 nm波长处基线平稳，色谱峰信息较完全，故选择其为检测波长。

表4 12批补中益气丸（水丸）特征图谱共有峰的相对峰面积

色谱柱选择：本研究选取2个不同品牌色谱柱对样品进行测定，结果表明，通过Diamosil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）分离出的色谱峰之间分离度高，特征峰明显且稳定性好，故选择其作为色谱柱［7］。

柱温选择：为了选择分离效果适宜的柱温条件，确保指纹图谱的分离度和稳定性良好，控制在不同柱温下进行试验。柱温为25，27，30℃时，主要成分的色谱峰之间分离度及吸收强度均较好，柱温为30℃时，阿魏酸色谱峰与杂峰分离度最好［8］。

流速选择：分别采用流速为1.0mL/min和0.8mL/min进行试验，结果表明，当流速为0.8mL/min时主成分的色谱峰与周围各峰的分离更明显。

3.2 样品溶液制备方法优选

曾采用薄层色谱法考察不同提取溶剂的分离效果，甲醇的效果优于乙醇，故选用甲醇；为了考察不同溶剂浓度下的分离效果，采用70%甲醇溶液和100%甲醇回流提取2种方法，通过对比所生成的2组图谱，结果表明，100%甲醇回流提取效率较高，特征峰面积总和较大，各特征峰分离度较好，故被选定。

指纹图谱能表征组方中药味较多、成分复杂的中药制剂的整体信息，在中药质量的评价中应用较多。补中益气丸方中药味较多且成分复杂，本研究中选择其中具有代表性的6种指标成分进行考察，选择12个不同批次的样品丸剂，通过试验验证并建立了HPLC的分析方法，证实了该厂家该药物质量符合要求，为进一步对补中益气丸进行产品质量评估，从整体上有效且稳定地控制生产质量，以及建立一个快速、有效的评价中药成方制剂的质量控制方法打下基础，更需要合理修改一些现行的中药成方制剂的质量评价标准，能对药品质量的控制更加准确、稳定和严格，满足临床对有效性和安全性的需求［9-13］。所建立的补中益气丸（水丸）的中药指纹图谱为中药质量控制提供了理论依据，同时初步建立了补中益气丸（水丸）的HPLC指纹图谱，为加强对补中益气丸（水丸）这类经典中药名方内在质量控制的摸索提供一种较全面的分析手段。