间充质干细胞分泌因子调节氧化应激的作用

刘菡文，覃莲菊，崔毓桂

氧化应激（OS）是由于细胞内产生的活性氧簇（ROS）超过抗氧化反应系统承受能力的一种现象。氧化应激影响生殖系统，包括激素生成、卵母细胞的成熟、排卵、胚胎植入、黄体溶解和妊娠期黄体的维持[1]。卵泡液微环境中的巨噬细胞、白细胞等是ROS的重要来源，对卵巢有正面和负面的双重影响，即卵巢内适量的ROS能促进非优势卵泡凋亡，也能促进血管生成，增加卵巢内血流，促进卵泡破裂及排卵；但过多ROS积累会影响细胞内活性分子的结构与功能，如DNA损伤、脂质过氧化和酶蛋白活性损伤，甚至导致细胞凋亡。过多ROS和氧化应激与多种女性生殖疾病的发生发展有关，如子宫内膜异位症（EMs）、多囊卵巢综合征（PCOS）及不明原因不孕；还能导致复杂的病理妊娠，如自然流产、复发性流产、子痫前期及胎儿生长受限等[2-3]。氧化应激诱导卵巢内的细胞凋亡，也包括已排出的卵母细胞。卵巢组织和卵泡液中的ROS降低卵母细胞质量，降低排卵率、受精率、着床率以及活产率，即影响临床妊娠结局；而抗氧化剂治疗能降低ROS水平，降低氧化应激介导的生殖细胞凋亡，提高卵母细胞质量，有助于改善妊娠结局。

干细胞具有多向分化和自我更新能力。多种干细胞，如造血干细胞、胚胎干细胞（ESC）、间充质干细胞（MSC）、诱导多能干细胞、脂肪干细胞，已被用于临床细胞治疗或临床研究，而MSC相对于其他种类干细胞具有明显的优势，因其来源丰富、易于获得、低免疫原性且不存在伦理限制。研究表明，MSC治疗能降低宿主组织细胞内的氧化应激，如移植人羊膜MSC能激活宿主细胞外信号调节激酶/丝裂原活化蛋白激酶（ERK/MAPK）通路，减少细胞内ROS产生[4]；人绒毛膜MSC与内皮细胞共培养，能降低内皮细胞的氧化应激水平，提示MSC可作为炎症性疾病的治疗工具[5]。本文综述MSC分泌因子的抗氧化应激作用，阐述其可能的细胞内作用机制。

1 氧化应激与生殖疾病

ROS是在细胞代谢、氧气消耗的关键过程中产生的一类具有高活性的小分子化合物，包括超氧阴离子（O2-）、过氧化氢（H2O2）和羟基自由基（HO-）等。细胞内大部分ROS是由线粒体呼吸链产生；存在金属离子时，也通过芬顿反应（一种非酶促反应）产生部分ROS[6]。

大多数疾病的发生发展，伴随着氧化应激水平升高，如PCOS、卵巢储备减少（DOR）和卵巢早衰（POF）、EMs等生殖内分泌疾病。研究发现，PCOS患者的血清前列腺素酶活性增加，总氧化应激水平和OS指数（总氧化剂与总抗氧化剂的比值）更高，且线粒体消耗O2减少、还原型谷胱甘肽（GSH）水平以及ROS产生增加；生理性高血糖使单核细胞ROS水平增加，激活肿瘤坏死因子α（TNF-α）及核因子-κB（NF-κB）表达。TNF-α具有拮抗胰岛素的作用，除参与PCOS患者胰岛素抵抗外，还参与卵巢细胞异常发育和多发性囊泡形成、慢性不排卵，导致不育[7]。

卵巢高ROS水平可能诱导线粒体DNA改变，使线粒体功能紊乱，氧化磷酸化功能受损，三磷酸腺苷（ATP）产生减少，从而导致卵子生成受损、卵母细胞数量减少，与POF的发生发展相关[8]。

再如，EMs患者的腹腔液中铁、铁蛋白和铁血红蛋白水平增高，这些铁离子参与芬顿反应产生ROS、诱导细胞的氧化应激，导致腹膜间皮的局部破坏，增加异位子宫内膜细胞的黏附[9]。

2 MSC的分泌因子及其细胞内作用机制

利用组织损伤的实验动物模型，移植MSC细胞或注射MSC培养上清，都可以显著改善受损器官的功能，说明MSC部分治疗作用是通过其分泌的可溶性细胞因子实现的[10]；除分泌因子外还包括细胞外囊泡、外泌体等[11]，这可能通过多种机制对受损组织发挥保护和促进再生的作用[12]：抗纤维化和抗凋亡、抗氧化应激、促血管生成、增殖和分化以及免疫调节。MSC分泌多种细胞因子，其中白细胞介素6（IL-6）、IL-8、脑源性神经营养因子（BDNF）、肝细胞生长因子（HGF）表达量较多，还包括TNF-α、血管内皮生长因子（VEGF）、白血病抑制因子（LIF）、胰岛素样生长因子1（IGF-1）、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子（FGF）、转化生长因子β（TGF-β）等因子[13-14]。

2.1 MSC分泌因子在生殖系统中的作用 MSC分泌因子可通过多种途径在生殖系统中产生多重作用。例如，IL-6作用于靶细胞，可通过酪氨酸蛋白激酶-转录激活因子3（JNK-STAT3）信号传导通路提高胚胎植入效率[15]，而STAT3可促进叉头盒蛋白O1（FOXO1）和FOXO3a基因的表达，FOXO1和FOXO3a两者具有升调节锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD）、过氧化氢酶（CAT）表达的作用（参见图1）[16]。再如，IL-8可能通过靶细胞内核苷酸结合寡聚化结构域蛋白1/酪氨酸蛋白激酶（NOD1/JNK）通路发挥作用，增加滋养层细胞对蜕膜的侵袭力[17]；NOD1还启动MAPK依赖性基因的表达，MAPK在此具有激活Keap1-Nrf2-ARE通路的作用（后文详述）[18]。

颗粒细胞和卵丘细胞存在受体p75及神经营养酪氨酸激酶2型受体（NTRK2）。研究发现，BDNF可作用于颗粒细胞/卵丘细胞的受体p75和NTRK2，进而促进水牛卵母细胞的体外成熟率和体外胚胎培养的囊胚形成率[19]。HGF作用于卵巢靶组织，可通过激活沉默信息调节因子（SIRT）/FOXO1信号通路减少靶细胞的氧化应激，改善自然衰老过程的卵巢功能[20]。TNF-α可激活靶组织细胞的磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADPH）氧化酶亚基p47及NF-κB亚基p65，诱导H2O2和其他超氧化物的产生[21]，增加ROS产生和氧化应激。

实验研究表明，超表达VEGF可使细胞内MAPK信号通路相关的磷酸化亚基p38表达增加，并因此减少细胞凋亡；相反，使用VEGF拮抗剂，可增加细胞凋亡[22]。LIF作用于靶细胞，增加Stat3与线粒体解偶联蛋白2（UCP2）启动子区域的结合，因此增加UCP2 mRNA的表达，后者具有保护细胞免受ROS致凋亡的作用[23]。

近来研究发现，MSC能分泌的外泌体发挥“远程”作用，这些外泌体可激活内皮细胞中的磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路，增强细胞的增殖和迁移，促进靶器官的血管形成[24]。

MSC分泌因子在生殖系统的作用见图1。

图1 MSC分泌因子（部分）及其细胞内作用机制的模式图

2.2MSC分泌因子激活Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1-核因子E2相关因子2-抗氧化反应元件（Keap1-Nrf2-ARE）通路参与抗氧化反应 以Keap1-Nrf2-ARE通路为例，介绍MSC分泌因子抗氧化应激的作用。生理条件下，氧化应激水平增加伴随着抗氧化反应的增强。体内具有抗氧化作用的酶主要有超氧化物歧化酶（SOD，有SOD1和SOD2型）、CAT、血红素加氧酶1（Ho-1）和还原型谷胱甘肽（GSH）等[25]，这些酶参与谷胱甘肽合成、活性氧清除、异生物代谢和排出、药物转运，通过分解过多的ROS降低了细胞的氧化应激水平，从而维持细胞的内稳态。细胞内这些酶的生成主要受Keap1-Nrf2-ARE通路的调控。Nrf2是诱导细胞防御系统的主要调控因子，介导了100多个氧化应激相关保护基因的表达，包括抗氧化酶、Ⅰ期和Ⅱ期解毒酶、转运蛋白、蛋白酶体亚基、分子伴侣蛋白、生长因子及其受体、以及一些核转录因子[26]。这些细胞保护因子，在其基因启动子调控区均含有顺式调节元件序列“ARE”，即5’-GTGACnnnGC-3’；Nrf2与ARE结合后，启动上述细胞保护因子的表达，诸如SOD等多种抗氧化酶。

Nrf2的活性受Keap1调控。在正常生理条件下，Keap1与Nrf2结合，使Nrf2泛素化；泛素化的Nrf2无法进入细胞核与ARE结合，导致细胞保护因子表达下降；在低水平氧化应激时，Keap1被灭活，Nrf2的泛素化停止，Nrf2顺利进入细胞核与ARE结合（Nrf2因此被活化），同时新合成Nrf2积累，诱导一系列细胞保护基因的转录，激活抗氧化防御系统[27]。因此，“氧化应激—抗氧化防御”处于动态平衡之中。再如，氧化应激可能破坏细胞自噬，即细胞清除自身受损细胞器和错误折叠蛋白的能力受损，自噬相关蛋白p62积聚并将Keap1隔离，Keap1不再与Nrf2结合；与Keap1分离的Nrf2转入细胞核，诱导一系列细胞保护基因的转录，激活抗氧化防御系统，建立“氧化应激—抗氧化防御”再平衡[27]。细胞内Keap1-Nrf2-ARE通路一旦受损，机体调节氧化应激的能力会受很大影响。Nrf2敲除小鼠虽然发育正常，但易发生氧化应激相关的疾病，如化学性致癌[28]、急性化学性肺损伤（ALI）等[29]。

细胞内有多条信号通路能激活Keap1-Nrf2-ARE从而调节氧化应激水平。研究发现，MAPK和PI3K/Akt信号可激活Nrf2-ARE通路，增强GSH、SOD、NADPH醌氧化还原酶1（NQO-1）的表达，降低细胞内ROS，发挥抗氧化应激的作用[30]，见图1。

IL-6是一种多功能细胞因子，可调节免疫和炎症反应，抑制炎症过程的细胞凋亡。在口腔鳞状细胞癌放射治疗中，IL-6在组织中高表达。其促进了下游分子STAT3的活化，上调细胞中p62与Keap1相互作用促进Nrf2的活化；活化的Nrf2可促进Nrf2依赖性的ROS清除因子Mn-SOD表达，减少ROS及超氧化物的数量，降低细胞氧化应激水平，并可减少放疗后细胞双链DNA断裂数，抑制细胞凋亡，使口腔鳞状细胞癌细胞产生辐射抗性[31]。与IL-6类似，BDNF也通过Keap1-Nrf2-ARE通路发挥抗氧化应激作用。在神经系统中，BDNF能增强神经元中谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶、SOD等抗氧化酶的活性，调节细胞内稳态[32]；在小鼠大脑中，BDNF能激活星形胶质细胞Nrf2-ARE通路，降低细胞内氧化应激水平，对铁超载所致细胞毒性起保护作用[33]。MSC分泌多种细胞因子，包括IL-6、IL-8、BDNF、VEGF等，但是对生殖系统中Nrf2-Keap1-ARE通路及其抗氧化应激作用的研究很少，图1所示大多基于其他系统和其他组织细胞的研究结果。

3 MSC在生殖领域的应用研究

MSC已应用于多种疾病临床治疗或临床研究。在生殖领域中，MSC通过其多向分化能力及其分泌的细胞因子改善许多生殖疾病的症状，如子宫内膜粘连、PCOS、POF等生殖内分泌疾病。笔者推论，MSCs分泌众多细胞因子及其参与的抗氧化作用，是MSC治疗多种生殖内分泌疾病的共同机制之一。

3.1 MSC在子宫内膜粘连疾病中的应用 Asherman综合征（AS）是由于子宫内膜破坏导致宫颈或宫腔内膜粘连，患者可出现闭经、少经甚至不育，部分AS患者手术及激素治疗后症状仍未改善。将子宫内膜间充质干细胞（eMSCs）移植到AS模型大鼠，大鼠的生育能力显著改善[34]，表明eMSC移植可作为治疗AS的潜在治疗手段。向子宫内膜粘连模型大鼠体内移植骨髓MSC，可使子宫内膜增厚，腺体数目增多，纤维化面积减少[35]。MSC改善子宫内膜条件，为胚胎种植和胚胎发育创造良好条件，这可能为那些子宫内膜粘连导致胚胎反复种植失败的患者提供新的治疗手段。

3.2 MSC在PCOS中的应用 给予PCOS模型大鼠体内注射骨髓间充质干细胞（BM-MSC），PCOS+BMMSCs组与PCOS组相比，血清卵泡刺激素（FSH）升高，而黄体生成激素（LH）及睾酮降低，改善PCOS模型鼠体内激素水平；细胞总抗氧化能力（TAC）升高，而细胞丙二醛（MDA）水平及细胞凋亡率降低，降低了PCOS模型鼠细胞内氧化应激水平；卵巢内形态健康的大型窦卵泡数、卵母细胞体积、透明带厚度增加，而初级卵泡和窦前卵泡数减少，有利于PCOS模型鼠排卵[36]。另一项研究中，从PCOS模型小鼠取得未成熟卵，体外培养成熟（IVM）时添加骨髓间充质干细胞的培养液，能显著提高小鼠卵母细胞的质成熟和核成熟，使核质成熟趋于同步，因而提高IVM卵母细胞的受精率、卵裂率和囊胚形成率[14]。

3.3 MSC在POF疾病中的应用 骨髓MSC能分泌多种生长因子，包括VEGF、IGF-1和HGF。用紫杉醇处理大鼠建立POF模型，静脉注射给予骨髓MSC，能改善卵巢微环境从而改善POF症状和卵泡形成[37]。体外实验中将卵巢组织与骨髓MSC共培养，MSC能上调卵巢组织的Bcl-2表达、减少生殖细胞凋亡，提升卵巢质量[38]。体内和体外的研究中，MSC均改善卵巢功能，可能通过MSC分泌因子改善卵巢微环境，但确切机制仍需要进一步探索。

4 展望

实验研究和少量临床研究均表明，MSC治疗能改善卵巢功能减退、POF患者的卵巢功能和临床妊娠结局，对于子宫内膜粘连导致的反复种植失败也有较好的治疗作用。MSC分泌众多细胞因子，如IL-6、BDNF可通过激活Keap1-Nrf2-ARE信号通路减少氧化应激水平；VEGF、IGF-1、HGF能上调Bcl-2，减少生殖细胞凋亡。但MSC的众多细胞因子及其组合在体内的作用机制仍需更多研究。本文介绍了MSC分泌因子的抗氧化应激作用，为后续研究MSC的临床治疗应用提供新思路。