IL-2（rs6822844）和IL-2Ra（rs2104286）单核苷酸多态性与原因不明复发性流产的相关性研究

邓妙，张红艳，王冲，刘元伟，盛祝梅，张治芬

目前复发性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）的诊断标准尚不统一，我国通常将3次或3次以上，在妊娠28周之前的胎儿丢失称为RSA[1]。RSA病因复杂，近年来，免疫因素在RSA中的作用越来越受到重视。研究显示，约50%的RSA存在免疫功能紊乱[2]。免疫因素包括自身免疫和同种免疫，其中同种免疫型RSA仍处于研究阶段，被称为原因不明复发性流产（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）。辅助性T细胞1型/辅助性T细胞2型（Th1/Th2）比例失衡与多种免疫性疾病有关，也是URSA的重要机制[3-5]。研究显示，白细胞介素2基因[IL-2（rs6822844）]及其受体α[IL-2Ra（rs2104286）]单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）与类风湿性关节炎、系统性硬化病、支气管哮喘、1型糖尿病等多种Th1/Th2失衡性疾病有关[6-10]。然而，上述位点与URSA的相关研究目前未见报道。因此，本研究以中国浙江地区URSA患者为病例组，正常足月分娩的孕妇为对照组，分析2组患者上述位点等位基因和基因型频率的分布差异，旨在探讨IL-2（rs6822844）、IL-2Ra（rs2104286）与URSA的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2016年1月—2019年3月在杭州市妇产科医院就诊的URSA女性患者设为URSA组（145例），纳入标准：URSA诊断标准参照2016年中华医学会妇产科学分会产科学组标准[1]。夫妻均行染色体核型分析、血常规、C-反应蛋白、生殖道分泌物解脲支原体、沙眼衣原体和淋球菌培养、艾滋病病毒抗体、梅毒特异性抗体、乙型肝炎病毒免疫学、弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒及其他病原微生物、生化、凝血功能、血黏度、性激素、甲状腺功能、生殖道超声检查、抗磷脂抗体、抗核抗体检查，男方行精液检查，排除遗传、感染、内分泌、解剖、血栓前状态、自身免疫、男方因素等的影响。另以随机数字法选取同期来本院正常足月分娩的孕妇为对照组（220例），纳入标准：本次正常足月分娩，既往无自然流产、异位妊娠、早产史，无妊娠期糖尿病、妊娠期高血压病史，无血栓栓塞、免疫性疾病及家族遗传病史。2组患者均为浙江杭州地区汉族女性。URSA组年龄26～34岁，平均（29.68±2.35）岁，对照组年龄23～36岁，平均（29.12±3.54）岁，2组患者年龄比较，差异无统计学意义（t=1.805，P=0.072）。

1.2 方法

1.2.1 标本采集及DNA提取2组病例均空腹采集2 mL静脉血，乙二胺四乙酸二钾抗凝。用购自北京天根生化科技有限公司的全血基因组DNA提取试剂盒，按说明书操作，提取的DNA样本放置-80 ℃备用。

1.2.2 基因型测定应用实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR），扩增引物由上海辉睿生物技术有限公司合成。引物序列及扩增条件，见表1。反应体系：50 μL反应体系，10×PCR缓冲液（无Mg2+）5 μL，10 mmol/L dNTPs 4 μL，25 mmol/L Mg2+3 μL，10 μmol/L正反向引物各1 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶1 μL，基因组DNA 5 μL，加注射用水至总体积50 μL。由上海生工生物工程股份有限公司完成PCR产物测定。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件分析。基因型和等位基因频率在群体中的代表性采用Hardy-Weinberg平衡检验；基因型、等位基因与URSA的相对风险率OR的95%CI计算采用Miettinen法；2组基因型、等位基因频率比较均采用χ2检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 遗传平衡检验 URSA组IL-2Rα（rs2104286）AA基因型频率观察值为88.62%，如符合Hardy-Weinberg遗传平衡法则，AA基因型频率=A等位基因频率2，计算得A等位基因频率期待值为88.66%，同理得G等位基因频率期待值为11.75%。观察值和期待值比较差异无统计学意义（χ2=0.013，P=0.909），因此IL-2Rα （rs2104286） 基 因 型 频 率 符 合Hardy-Weinberg遗传平衡法则，见表2。

2.2 IL-2（rs6822844）基因型及等位基因频率分析2组研究对象IL-2（rs6822844）等位基因均为G，基因型均为GG，均未发现SNPs分布，见图1（后插一）。

图1 IL-2（rs6822844）GG基因型测序图

2.3 IL-2Rα（rs2104286）基因型及等位基因频率分析 2组研究对象IL-2Rα（rs2104286）位点均存在SNPs分布，共检测出3种基因型，分别为AA、AG、GG，见图2（后插一）。URSA组A等位基因频率（88.62%）高于对照组（79.09%），且A等位基因携带者URSA患病风险是G等位基因携带者的2倍（OR=2.06，95%CI：1.34～3.16，P=0.001）。URSA组AA基因型频率（78.62%）高于对照组（61.81%），且AA基因型较AG+GG基因型URSA患病风险增加约1倍（OR=2.27，95%CI：1.40～3.68，P=0.001），见表3。

图2 IL-2Rα（rs2104286）3种基因型测序图

3 讨论

目前RSA的诊断标准尚不统一，与我国中华医学会对RSA的定义不同，美国生殖医学会将2次或2次以上的妊娠失败定义为RSA[11]，英国皇家妇产科医师协会的标准则为同一性伴侣连续3次或3次以上24周前的胎儿丢失[12]。美国生殖医学会的指南同时指出，生育年龄女性2次或2次以上自然流产率约5%，3次或3次以上自然流产率约1%[11]。RSA给患者身心健康、家庭稳定、社会医疗支出等造成了严重影响。RSA病因复杂，主要包括遗传、内分泌、感染、解剖、自身免疫性疾病、血栓前状态、全身性疾病及环境影响等，但仍有半数的RSA病因不明，被称为URSA，又称同种免疫型RSA。目前认为，URSA与封闭抗体缺乏、NK细胞数量和活性异常及Th1/Th2细胞因子异常密切相关[1]。

表1 引物序列及扩增条件

表2 IL-2Rα（rs2104286）Hardy-Weinberg遗传平衡检验

表3 IL-2Rα（rs2104286）等位基因和基因型频率分布

Th1和Th2型细胞是CD4+T细胞的两个功能亚群，根据分泌不同的细胞因子区分。Th1型细胞主要分泌IL-2、干扰素（IFN）和肿瘤坏死因子（TNF），促进炎性反应和细胞免疫、直接或间接地损伤胎盘，对胚胎起免疫损伤作用；Th2型细胞主要分泌IL-4、IL-5和IL-10，介导B细胞增殖、抑制巨噬细胞分泌炎性因子、维持同种免疫耐受状态，对胚胎起免疫保护作用。正常母胎界面以Th2型细胞因子占优势，若Th1/Th2型细胞因子平衡向Th1偏移可导致不良妊娠[13-14]。细胞因子的合成受遗传因素影响，细胞因子基因多态性主要为微卫星基因多态性和SNPs。其中SNPs是指基因组DNA由于单个核苷酸（A、T、C、G）的改变引起的DNA序列变化，从而造成不同物种间或人体内基因的多样性。SNPs具有遗传高稳定性、高信息量和检测方法多样性的优点，在病例对照相关分析中被广泛应用。Aslebahar等[15]的Meta分析纳入了29个病例对照研究，结果显示TNF-α-308 SNP位点GG基因型RSA的发病风险是AA基因型的1.76倍（OR=1.76，95%CI：1.21～2.43，P=0.002）。进一步分层分析显示，亚洲人种携带GG基因型RSA发病风险更高（OR=2.19，95%CI：1.47～3.27，P＜0.001）。Ma等[16]对中国汉族人群的研究显示IFN-γ-874 SNP位点A/T等位基因及基因型与URSA无相关性。IL-2是Th1型细胞分泌的另一重要细胞因子，同时IL-2又能诱导Th1型细胞分化增殖，从而相互促进。IL-2通过与细胞膜上的IL-2R结合发挥作用，IL-2R有3个亚单位，分别为IL-2Rα链（CD25）、IL-2Rβ 链（CDl22）和IL-2Rγ链（CDl32）[17]。研究显示，IL-2（rs6822844）、IL-2Rα（rs2104286）与多种Th1/Th2失衡性疾病相关[6-10]。然而，上述位点与URSA的相关性研究目前未见报道。

本研究以浙江地区145例URSA患者为病例组，220例正常分娩人群为对照组。结果显示，2组研究对象IL-2（rs6822844）等位基因均为G，未发现SNP分布，究其原因可能与人种及地域相关。Louahchi等[6]的研究显示IL-2（rs6822844）A等位基因与阿尔及利亚马格里布地区摩洛哥人类风湿性关节炎发病密切相关（OR=2.57，95%CI：1.74～3.83，P=0.001）。但郑绪阳等[8]在分析IL-2基因多态性与浙江地区汉族儿童支气管哮喘的关联时发现，IL-2（rs6822844）等位基因也均为G，未发现SNP分布。本研究显示，URSA组IL-2Rα（rs2104286）A等位基因和AA基因型频率均高于对照组，差异均有统计学意义。且A等位基因携带者URSA患病风险是G等位基因携带者的2倍，AA基因型较AG+GG基因型URSA患病风险增加约1倍。提示IL-2Rα（rs2104286）A等位基因可能是浙江地区URSA的遗传易感基因。人IL-2R位于第10号染色体短臂上（10p14.15），由8个外显子和7个内含子构成，IL-2Rα（rs2104286）位于该基因第一个内含子内，提示rs2104286可能是一个功能性位点[17]。Wang等[18]的Meta分析显示，IL-2Rα（s2104286）A等位基因分别与白种人（OR=1.19，95%CI：1.13～1.25，P＜0.001）和亚洲人（OR=1.25，95%CI：1.01～1.55，P=0.041）多发性硬化症风险增加有关。Tang等[19]的Meta分析共纳入了19项独立研究、23 528个样本，结果显示IL-2Rα（rs2104286）A等位基因与1型糖尿病的发病相关（OR=1.24，95%CI：1.17～1.30，P＜0.001）。郑绪阳等[8]的研究也显示，IL-2Rα（rs2104286）A等位基因与浙江地区汉族儿童支气管哮喘发病相关（OR=1.708，95%CI：1.11～2.63，P=0.01）。因此，我们认为IL-2Rα（rs2104286）A等位基因可能是多种免疫性疾病共同的易患基因。

URSA的治疗方案包括子宫内膜干细胞样细胞治疗、免疫细胞和免疫球蛋白灌注治疗、粒细胞集落刺激因子治疗、环孢素、糖皮质激素、TNF-α和维生素D等，目前研究主要集中在淋巴细胞免疫治疗和静脉注射丙种球蛋白，但对其疗效目前仍有争议[12,20-21]。Chen等[20]的研究显示，与常规黄体酮保胎的URSA患者相比，淋巴细胞主动免疫治疗组流产率明显降低，妊娠成功率明显升高（2组妊娠率分别为89.7%和32.2%），差异有统计学意义（P＜0.05）。但英国皇家妇产科协会的指南指出，淋巴细胞主动免疫治疗及静脉注射丙种球蛋白等免疫疗法并不显著提高RSA患者的活产率[12]。因此，新的、有效的URSA免疫治疗方案仍待探索。郑绪阳等[8]的研究同时显示，IL-2Rα（rs2104286）AA基因型个体外周血IL-2Rα mRNA相对表达量以及血浆IL-2Rα水平均高于AG基因型（Z分别为－2.029和－2.361，P=0.043和0.018），提示IL-2Rα（rs2104286）AA基因型同时影响了其转录和表达，从而升高了浙江地区汉族儿童支气管哮喘的发病率。研究显示，IL-2Rα（CD25）单克隆抗体在多种免疫性疾病的治疗中发挥作用。陶涛等[22]研究CD25单抗治疗异基因造血干细胞移植后合并糖皮质激素耐药型急性移植物抗宿主病的效果，结果显示治疗总有效率达75.0%，其中完全缓解率达52.5%。Tang等[23]的研究显示，CD25单抗可以通过抑制CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞增强日本血吸虫疫苗的保护作用。CD25单抗的作用机制主要包括促进T细胞有丝分裂、增强T细胞和NK细胞的杀伤功能及辅助抗体生成[22-24]。目前未见CD25单抗用于URSA治疗的报道，结合上述研究，我们认为CD25单抗可以作为治疗URSA的一个潜在方案进一步研究。

综上所述，IL-2Rα（rs2104286）A等位基因可能是浙江地区URSA 的遗传易感基因，IL -2（rs6822844）基因多态性与浙江地区URSA无相关性。今后有必要进一步扩大样本含量，开展多中心临床研究，综合分析IL-2Rα、IL-2Rβ 和IL-2Rγ SNPs、单倍型及单倍型组合与URSA发病风险的相关性，进而进行基因功能研究和免疫治疗安全性、有效性研究，探讨URSA发病的遗传因素和分子机制，为临床诊断、预防和治疗提供理论依据。