肉苁蓉对帕金森病模型大鼠PI3K、Akt、Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

★ 林瑶杨莎莎 刘婷 许茜 付建华 蔡晶

(1.福建中医药大学中西医结合学院 福州350122；2.福建中医药大学中西医结合研究院 福州 350122；3.中国中医科学院西苑医院 北京 100091)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)的主要病理特征是黑质纹状体致密部多巴胺能神经元进行性丢失，其发病的重要机制之一是多巴胺能神经细胞的凋亡[1]。在细胞凋亡机制涉及的众多信号转导通路中，PI3K/ Akt因参与调控凋亡蛋白和凋亡基因发挥抑制细胞凋亡的作用而受到重视[2]。已有研究表明，多种PD模型及PD患者均存在PI3K/ Akt信号通路的减弱或异常调节[3-4]。

肉苁蓉(Herba Cistanche)为肉苁蓉属植物干燥带鳞叶的肉质茎，能补肾阳、益精血，被誉为“沙漠人参”。本课题组前期研究发现肉苁蓉能调节多巴胺能神经细胞凋亡因子的表达，减轻多巴胺能神经细胞的凋亡[5]。但是肉苁蓉是否通过PI3K/Akt通路发挥神经保护作用尚需进一步探讨。本实验通过观察肉苁蓉对PD模型大鼠行为学以及黑质纹状体中PI3K、Akt、Bcl-2、Bax蛋白表达的影响，探讨肉苁蓉减轻多巴胺神经细胞凋亡的机制。

1 材料

1.1 实验动物 福建中医药大学实验动物中心提供实验动物和普通级医学实验动物环境设施，实验动物合格证号为SCXK2014-0012，具体为SD健康雄性大鼠(SPF 级)，6～7周龄，数量48只，每只体重(210±30)g。

1.2 试剂与仪器 肉苁蓉颗粒剂(福建中医药大学附属第三人民医院)；鱼藤酮(美国Sigma公司，批号R3875)；葵籽油(美国Sigma公司，批号S5007)；PI3K 抗体(美国CST公司，批号19H8)；Akt 抗体(武汉三鹰，批号66009-1：)；Bcl-2抗体(美国CST公司，批号15071：)；Bax抗体(美国CST公司，批号5023：)；β-actin(武汉三鹰，批号60203)；电泳槽与转膜仪(美国 Bio-Rad 公司)；5417R 高速冷冻离心机(德国 Eppendorf 公司)；DU-650 型蛋白分析仪(美国 Beckman 公司)；Gel DOC 2000 型凝胶成像分析系统(美国 Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 分组 6～7周龄的SPF级SD雄性大鼠48只，随机法分为正常组、溶剂对照组、模型组以及肉苁蓉低、中、高剂量组，每组各8只。普通环境饲养，自由饮水。

2.2 造模与干预 溶剂对照组给予颈背部皮下注射葵花油乳化液(1.5 mg/kg/d)，1次/d，连续14d；模型组、肉苁蓉低、中、高剂量组颈背部皮下注射鱼藤酮葵花油乳化液(1.5 mg/kg/d)建立PD模型，注射7d休息1天，共15d，造模结束后按照行为评分标准选取造模成功的大鼠(造模方法及行为评分标准均参照陈忻等[6]的方法)。造模成功后，肉苁蓉低、中、高剂量组分别给予0.54 g/kg/d、1.08 g/kg/d、2.16 g/kg/d肉苁蓉水煎剂灌胃(肉苁蓉低、中、高剂量根据课题组前期实验的结果确定[15])，1次/d，连续14d。正常组、溶剂对照组及模型组给予等体积生理盐水灌胃，频次同肉苁蓉组。给药剂量均按人和大鼠间体表面积折算的等效剂量给药。

2.3 行为学检测 各组进行肉苁蓉干预后，分别在第3、7、14天进行行为学的步幅试验，同时记录相应的数据。步幅试验操作方法如下：制作不透光的木盒子，带有长 42 cm，宽4.5 cm，高10 cm的跑道，在跑道上放置宽4.5 cm，长40 cm的白纸。将大鼠的前爪涂上墨水，训练大鼠在跑道上行走并让其穿过盒子，测量白纸上大鼠2个前爪印记之间的距离(取脚印的中心)，此即步幅。每次测量3个最长的步幅(对应大鼠行走的最大速度)。 若出现大鼠在行走过程中停止，或者有明显减速的情形，则重新进行测试。

2.4 实验取材 最后一次给药的12h后，从每组中随机抽取6只大鼠，采用乙醚麻醉，迅速断头处理，于冰盘上提取以中脑黑质为主的脑组织，脑组织表面的血液用冰0.9% 氯化钠溶液冲洗干净，残余液体用滤纸吸干，置于-80 ℃冰箱保存备用。

2.5 提取蛋白 将样品从-80 ℃冰箱中取出，称重后放入研磨器研碎，按12.5μL/mg加入RIRA裂解液，冰上裂解30min，使用1mL注射器反复抽吸20次。接着将样品放入4℃离心机中离心15min，离心机转速为12000r/min，之后每组样品各吸取30μL上清液到新的离心管中，用BCA法测定蛋白浓度，其余上清液以4∶1的比例加入5×buffer溶液，混合均匀后，在水浴锅中煮沸10min，之后置于-80℃冰箱备用。

2.6 Western Blot 法检测 PI3K、Akt、Bcl-2、Bax蛋白表达 将各组蛋白浓度总量调整为30μg/μL，将样品加入到10%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，转膜至PVDF膜后，按1∶1000的稀释比例加入一抗PI3K、Akt、Bcl-2、Bax。隔天取出条带用二抗(1∶2000)孵育1h，TBST清洗后，采用ECL试剂盒显影并成像，用Image Lab软件进行半定量分析，并记录相应条带的灰度值。

3 结果

3.1 6组大鼠步幅比较 肉苁蓉干预后第3、7、14天，模型组大鼠步幅比正常组明显下降(P<0.01)；肉苁蓉给药后各组步幅有显著性差异，其中肉苁蓉干预第7天，高剂量组步幅较模型组有显著增加(P<0.01)；而肉苁蓉干预14天后，中、高剂量组步幅较模型组均出现明显增长(P<0.01)。见表1。

3.2 6组大鼠黑质纹状体PI3K、Akt、Bcl-2、Bax蛋白表达及Bcl-2/Bax值比较 与正常组比较，模型组PI3K、Akt、Bcl-2蛋白表达、Bcl-2/Bax值均明显降低(P<0.01或P<0.05)，Bax蛋白表达显著升高(P<0.01)。而与模型组相比，肉苁蓉低、中、高剂量组PI3K表达明显升高(P<0.01或P<0.05)，中剂量组Akt明显升高(P<0.01)，低、中、高剂量组Bcl-2蛋白表达、Bcl-2/Bax值均显著升高(P<0.01)，Bax蛋白表达明显降低(P<0.01)。见表2、图1。

表1 6组大鼠步幅比较±s,n=8)

注：与正常组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.01。

表2 6组大鼠黑质纹状体PI3K、Akt、Bcl-2、Bax蛋白表达

注：与正常组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。

依次为：正常组，溶剂对照组，模型组，低剂量组，中剂量组，高剂量组

4 讨论

PD是一种常见的神经系统退行性疾病，主要的发病机制是多巴胺能神经细胞的凋亡，有效抑制或减少细胞凋亡是实现神经保护的重要手段。中医理论认为， PD虽然病位在脑，但是病机实为肾虚髓空，可通过补益肾脏来濡养脑髓。而肉苁蓉性甘、咸，温；归肾、大肠经；补肾阳，益精血，润肠通便，是传统补肾中药[7]。现有的研究已表明，肉苁蓉可以抗氧化、抗衰老，能够提高细胞中多种中枢神经递质的含量，起到神经保护作用[8]。本课题组前期研究也发现多味补肾中药如淫羊藿、菟丝子、肉苁蓉等均可增加细胞中神经营养因子含量，减少相关神经凋亡因子含量，从而抑制多巴胺神经细胞的凋亡，其中又以肉苁蓉作用最为突出[9]。

PI3K/Akt是一条经典的细胞信号转导通路，在神经系统中广泛存在，PI3K/AKT激活后可以调节其下游的凋亡相关蛋白，如Bcl-2 蛋白和Bax蛋白，使Bcl-2/Bax值升高，发挥抑制神经细胞凋亡的作用[10-14]。本实验结果发现，肉苁蓉干预后第7天，高剂量组步幅较模型组有显著增加，而肉苁蓉干预后第14天，中、高剂量组的步幅均出现明显增长，提示一定剂量的肉苁蓉作用一段时间后能改善PD模型大鼠的行为障碍，这与本课题组之前的研究结论一致[15]。同时Western Blot结果显示，模型组PI3K、Akt、Bcl-2表达、Bcl-2/Bax值均较正常组显著降低，Bax表达较正常组升高；给予肉苁蓉后，与模型组相比，给药组PI3K、Akt、Bcl-2表达、Bcl-2/Bax值升高，Bax水平降低，提示肉苁蓉可能是通过影响PI3K/Akt信号通路，增加Bcl-2表达、降低Bax表达，从而升高Bcl-2/Bax比值，减轻神经细胞凋亡来发挥神经保护作用的。本次实验还发现肉苁蓉中剂量组无论是步幅实验，还是PI3K、Akt、Bcl-2、Bax的蛋白表达的变化均表现明显，可考虑将这个剂量作为下一步实验的最适浓度。另外，由于要确定肉苁蓉对PI3K/Akt通路的激活作用，需要使用通路抑制剂进行研究，这可作为下一步深入探讨机制的思路。