肺炎支原体肺炎诱导痰中肺炎支原体核酸检测研究

谢红波 王春凤 陈水文 王世俊 刘纯义

深圳市宝安区妇幼保健院儿科，广东深圳 518100

肺炎支原体肺炎（MPP）是由肺炎支原体引起的常见呼吸道疾病[1]。MPP 的主要治疗方法为大环内酯类抗生素治疗，但肺炎支原体耐药株的出现导致了重症和难治性肺炎支原体肺炎（RMPP）的增加，严重危害了患儿及其家人的健康和生活[2]。MPP 诊断的金标准为培养法，具体为对咽拭子、咽喉或气管吸出物、胸腔穿刺液或肺泡灌洗液等送检MP 培养和分离。MP 培养条件苛刻，生长缓慢，因而缺乏早期诊断价值[3]。采集疑似MPP 患儿诱导痰，并进行诱导痰MP 核酸（MP-DNA）检测，有助于迅速确诊MPP[4]，本研究对疑似MPP 患者诱导痰中（MP-DNA）进行检测，考察MP-DNA 分布特性，并与金标准进行对比，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016 年12 月～2017 年11 月在深圳市宝安区妇幼保健院进行诊断的疑似MPP 患儿480例。其中男231 例，女249 例；0 ～3 岁患儿72 例，4 ～7 岁患儿248 例，8 ～12 岁患儿160 例；就诊月份1 ～3 月108 例，4 ～6 月94 例，7 ～9 月119 例，10 ～12 月159 例。入选标准：有呼吸道症状伴或不伴发热，疑似MPP 患儿。排除标准：既往患支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肾脏或肝脏疾病、反复呼吸道感染、有重症肺炎病史仍未痊愈先天性或继发性免疫抑制或缺陷、心血管疾病及结缔组织疾病患儿。

将患儿根据性别分为男性组，女性组，两组患儿的年龄及就诊月份差异无统计学意义（P＞0.05）；将患儿根据年龄分为0 ～3 岁组、4 ～7 岁组和8 ～12 岁组，三组患儿的性别及就诊月份差异无统计学意义（P＞0.05）；将患儿根据就诊月份分为1 ～3 月 组，4 ～6 月 组，7 ～9 月 组，10 ～12月组，四组患儿的性别及年龄差异无统计学意义（P＞0.05）。

本研究经深圳市宝安区妇幼保健院医学伦理委员会审批同意，患儿家属签署参与研究知情同意书。

1.2 研究方法

诱导痰采集：患儿充分漱口后，以浓度为3%高渗盐水超声雾化吸入15min，感觉有痰液随时咳出到清洁平皿中，取符合标准的痰液1mL，加入等量的痰液蓄积保护液，旋涡震荡3min，使其均匀，并于4℃环境下2000r/min 离心10min，取上清液，将采集到的痰液样本置于-70℃冰箱中保存待检。

肺炎支原体抗体检测：采用康华生物技术有限公司肺炎支原体IgM 抗体检测试剂盒（胶体金法）检测IgM 抗体。结果＞1 ∶40 为阳性。

MP-DNA 定量检测：采用中山大学达安基因股份有限公司生产的肺炎支原体核酸检测试剂盒（PCR 荧光探针法）检测患者诱导痰中MP-DNA。结果＞1×103copies/mL 为阳性。

1.3 观察指标

分析不同年龄、不同性别、不同月份MPP 患儿诱导痰中MP-DNA 检测阳性率，分析MP-DNA 与MP-IgM 结果的一致性。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 不同性别患儿诱导痰中MP-DNA检测阳性率

男性患儿MP-DNA 阳性率显著高于女性患儿，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.2 不同年龄患儿诱导痰中MP-DNA检测阳性率

三个年龄段患儿的MP-DNA 阳性率，差异有统计学意义（P＜0.05），差异具体表现为4 ～7 岁患儿MP-DNA 阳性率最高，其次为0 ～3 岁患儿和8 ～12 岁患儿。见表2。

表1 不同性别患儿诱导痰中MP-DNA检测阳性率统计学分析

表2 不同年龄患儿诱导痰中MP-DNA检测阳性率

2.3 不同月份患儿诱导痰中MP-DNA阳性率

不同月份患儿的MP-DNA 阳性率，差异有统计学意义（P＜0.05），差异具体表现为7 ～9 月份患儿MP-DNA 阳性率最高，其次为10 ～12 月份、1 ～3 月份和4 ～6 月份。见表3。

表3 不同月份患儿诱导痰中MP-DNA阳性率

2.4 MP-DNA与MP-IgM一致性

57 例MP-DNA 阳性患儿中MP-IgM 阳性例数为40 例，423 例MP-DNA 阴 性 患 儿 中MP-IgM 阴性例数为421 例，MP-DNA 与IP-IgM 的Kappa系数为0.795，二者高度一致。见表4。

3 讨论

肺炎支原体（MP）是儿童呼吸道感染的常见病原体，MPP 是儿童呼吸道感染的常见疾病。婴幼儿是MPP 发病的高危群体，但是其具体发病机制仍不十分清楚[5]。一般认为，MP 感染成为重症肺炎的重要原因，MP 会攻击并破坏机体的免疫系统，导致免疫防御屏障不完整，在MP 表面电子致密P1 蛋白末端结构的作用下，使其黏附于呼吸道黏膜上皮细胞上，进而破坏支气管、细支气管的黏膜层，破坏上皮纤毛活动，诱发阵发性咳嗽[6]。有试验在MPP 患儿的血液、脑脊液、皮肤水泡、胸水中分离出了MP，但是目前尚无权威资料证实MP 侵入和MPP 发病之间存在直接因果关系[7]。冯真英等[8]认为细胞免疫与体液免疫在MPP 的发病过程中担任了非常重要的角色，其作用发挥方式包括激活B 细胞和T细胞，激活NK 细胞、细胞毒性T 细胞以及巨噬细胞的溶细胞活力，激活免疫活性细胞并使其产生细胞白介素（如IL-2、IL-4、IL-6 等）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等，在炎性细胞因子的浸润作用下，肺泡壁会逐渐增厚，导致组织损伤。有研究结果显示，处于急性感染期的MPP 患儿会出现明显的细胞免疫功能抑制，表现为淋巴细胞对MP 的反应显著降低，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等生物抗原的反应性下降[9]。综合上述分析可知，MPP 患儿存在免疫系统平衡遭到破坏情况，T 淋巴细胞遭到抑制，尤其是CD8+T 细胞、B 淋巴细胞被激活，导致体液免疫功能失调。尽管目前MPP 的发病机制尚不明确，但有一点是非常明确的，MPP 是多种因素综合作用的结果，单一病因无法解释肺外所有症状，MP 对呼吸组织的直接侵犯作用不足以诱发MPP，而宿主免疫反应改变在MPP 发病过程中显得更加重要。因此，临床上普遍以免疫指标的变化情况作为MPP 临床诊断、轻重判定、治疗和预后的重要依据。

表4 MP-DNA与MP-IgM一致性

MP 在全球范围内存在，一般为散发性，3 ～6年可发生地区性流行，人群密集地区会集中发病；我国MP 引起的肺炎发病率高于国外地区[10]；在中国支原体肺炎有季节性特点，秋冬季发病率较高[11]；有2% ～5% 的MP 感染患儿发生肺炎，多有发热，伴有头痛和刺激性咳嗽[12]。MP 感染引起的儿童肺炎大部分为5 ～15 岁的少年儿童，偶然会在5 岁以下儿童中发生[13]。23% ～50% 的学龄前儿童和青少年社区获得性肺炎是由MP 感染导致的[14]。本研究结果显示，4 ～7 岁组MP-DNA 阳性率为15.32%，均高于其他年龄组，随着年龄的减小阳性率而降低；7 ～9 月份MP-DNA 阳性率为17.65%，均高于其他月份的阳性检测率，10 ～12 月份阳性率为14.47%，均明显高于1 ～6 月份，存在季节性差异，秋冬季发病率高；同时，男性患儿MP-DNA阳性率为15.58%，高于女性患儿的8.43%，与王福玲[15] 报道的一致。通过本研究发现，MP 感染患儿的阳性率为11.88%，远低于泉州[16]地区的检出率，但与北京通州[17]地区一致，可能与地域、取样季节和选择的检测对象有关。

感染的肺炎近年发病率持续升高，耐药性不断增加[18]，探讨早期、快速检测MP 方法非常重要。在临床上对顽固性剧咳、哮喘、持续发热和普通抗菌药物治疗无效的患者，应及时进行MP-DNA 检查，以免漏诊和误诊[19]。文献报道采用PCR 技术检测痰液标本中的MP，116 例标本中66 例标本PCR 试验阳性，32 例血清MP 抗体阳性，PCR 法灵敏度要高于血清学检测[20]。另外文献报道核酸检测阳性为87 例，真阳性85 例，灵敏度为85%，特异度96%；而抗体检测阳性为103 例，真阳性为70 例，灵敏度为70%，特异度为69%[21]。本研究显示MP-DNA检测与MP-IgM 及金标准具有高度一致性，血清学检测结果不能避免患儿的假阳性和假阴性问题，因为感染MP 肺炎的儿童，临床治疗治愈后体内仍存有一定强度的抗体滴度，接受抗体检测时会出现假阳性；而免疫缺陷不产生抗体或免疫力低下的儿童自身抗体滴度低，检测结果出现假阴性就会失去临床治疗的机会。但任何一种检测方法都有其检测范围和局限性，且还和标本取材有关。因此，MPDNA 和抗体联合检测才可以提高MP 检测的灵敏度和特异度。