5种动物源食品中的氟虫腈及其3个代谢物残留量检测

冯程程 刘新刚 董丰收

摘要 利用QuEChERS技术结合超高效液相色谱-串联质谱的方法检测5种动物源食品（鸡肉、鸡蛋、猪肝、牛奶、猪肉）中氟虫腈及其3个代谢物残留量。样品用乙腈提取，经低温处理，多壁碳纳米管（MWCNTs）、弗罗里硅土（Florisil）和C18分散固相萃取（d-SPE）净化，外标法定量。在不同浓度的加标水平下，氟虫腈及其代谢物在5种动物源食品中的平均回收率为72.1%～113.8%，相对标准偏差RSD为1.9%～17.6%，检出限LOD在0.73～1.94 μg/kg范围内，定量限LOQ在5～10 μg/kg范围内。该方法具有简单、灵敏、准确等优点，适用于动物源食品中氟虫腈及其代谢物的快速筛查和定量检测。

关键词 农药残留; 超高效液相色谱-串联质谱; 动物源食品; 氟虫腈

中图分类号： S 481.8  文献标识码： A  DOI： 10.16688/j.zwbh.2018235

Abstract The QuEChERS technique combined with ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry was used to detect the residues of fipronil and its three metabolites in five foods of animal origin including chicken， milk， eggs， pork liver and pork. The samples were extracted with acetonitrile， and then experienced low-temperature treatment， d-SPE purification of MWCNTs， Florisil and C18， BEH C18 by using the external standard method. At different concentrations， the average recoveries of fipronil and its metabolites in the five foods were in the range of 72.1%-113.8%， with RSD in the range of 1.9%-17.6%. The LOD was in the range of 0.73-1.94 μg/kg， and LOQ in the range of 5-10 μg/kg. This method is simple， sensitive and accurate. It is suitable for rapid screening and quantitative detection of fipronil and its metabolites in the foods animal origin.

Key words pesticide residue; UPLC-MS/MS; food of animal origin; fipronil

氟蟲腈（fipronil）是世界上首个苯基吡唑类杀虫剂，由法国Rhone-Poulenc公司开发[1]，化学名称为5-氨基-1-三氟甲基-4-三氟甲基亚磺酰基吡唑-3-腈。分子式为：C12H4Cl2F6N4OS。氟虫腈主要作用是与γ-氨基丁酸受体（GABA）结合，抑制氯离子通道，破坏中枢神经系统最终达到杀灭昆虫的目的[2]。由于氟虫腈是一种化学性质活泼化合物，在其施用后，经过水解、光解等作用，会生成3种代谢产物：氟虫腈砜（MB46136）、氟虫腈硫醚（MB45950）和氟甲腈（MB46513）。对其代谢物毒性的研究表明：这三者的毒性要高于氟虫腈原药[3]。

随着人们对畜产品肉、蛋、奶等的需求量逐渐增加以及对食品安全的重视程度的不断提高，国家食品药品监督局和农业部相关部门对畜产品质量也提出了更高的要求。农药残留易造成饲养环境污染，威胁畜产品的质量安全。因此开发快速、可靠、高灵敏度的农药残留检测技术是十分重要的。

关于氟虫腈残留检测最常见的方法是气相色谱-电子捕获检测法（GC-ECD）[4]、液相色谱法（LC）[5]、液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）[6]、气相色谱-质谱法（GC-MS）及固相微萃取-气相色谱-质谱法（SPME-GC-MS）[7]等。

QuEChERS方法于2003年由Michelangelo等提出[8]。QuEChERS方法具有操作简单、节省时间、对环境污染小、处理步骤少、分析效率高等优点，在食品、环境、生物等多种领域广泛应用，适用于农药多残留检测[9-10]。QuEChERS方法还可根据不同的吸附剂种类匹配不同的样品基质来消除基质干扰。最近几年，不断涌现出一些新型的吸附剂如碳纳米管、生物吸附剂等。其中多壁碳纳米管（MWCNTs）因其结构特点为内部中空的纳米级管，较大的比表面积和表面的疏水基团使其具有较强的吸附和去除色素的能力，被越来越多地应用于样品前处理过程中[11]。

本论文通过对液相色谱串联质谱方法以及前处理方法的优化，建立了QuEChERS技术结合超高效液相色谱-串联质谱检测5种动物源食品（鸡肉、鸡蛋、猪肝、牛奶、猪肉）中氟虫腈及其3个代谢物的残留的方法，并将此方法应用到来自14个省份的420个样品的检测中。通过对检测结果进行数据分析，为产品的风险评估分析提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

无水MgSO4、NaCl，北京北化精细化学品有限公司;色谱纯乙腈，Sigma-Aldrich， Germany;超纯水，由Milli-Q超纯水仪（Bedford， MA， USA）制备;MWCNTs、florisil、C18、氟甲腈标准品 （99.7%）、氟虫腈砜标准品（99.7%）、氟虫腈硫醚标准品（99.7%）由以色列马克西姆化学公司提供;0.22 μm滤膜，Agela Technologies，天津;超高效液相色谱串联四级杆质谱联用仪（Acquity UPLC-TQD），Waters公司;KQ-超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司;Milli-Q超纯水仪，美国Merck-Millipore公司;X1R高速冷冻离心机，美国Thermo公司;氮吹仪，北京八方世纪科技有限公司。

1.2 样品前处理方法

用万分之一天平称取氟虫腈（99.7%）、氟甲腈（99.7%）、氟虫腈硫醚（99.7%）和氟虫腈砜（99.7%）标准品各0.100 3 g，以色谱纯乙腈作为溶剂定容到100 mL，配制浓度为100 mg/L母液，转入棕色瓶置于-4℃冰箱保存。同时采用梯度稀释法配制0.5、1、2、10 mg/L和20 mg/L的系列标准溶液。

准确称取鸡肉、鸡蛋、牛奶、猪肉和猪肝各5.0 g样品（精确至0.1 g）于50 mL聚四氟乙烯离心管中，分别加入0.1 mL浓度为1、2和20 mg/L（牛奶、鸡蛋、猪肝）或0.5、1和10 mg/L（鸡肉和猪肉）的标准溶液，然后加入10 mL乙腈作为提取液，涡旋振荡1 min，室温下静置30 min。然后加入3 g NaCl 和2 g 无水MgSO4，涡旋振荡10 min， 以4 000 r/min离心3 min，取上清液1 mL，置于装有净化剂[50 mg florisil（C18）和150 mg无水MgSO4或10 mg MWCNTs （MW<8 nm）]的5 mL离心管，涡旋3 min，以4 000 r/min离心3 min。用无菌注射器抽取上清液，置于离心管中，过0.22 μm有机滤膜于进样小瓶中，用于进样。

1.3 液相色谱质谱条件

超高效液相色谱的构成为：具有色谱柱的加熱器、样品管理器和双通道溶剂管理器。Waters UPLC 色谱柱（Acquity BEH C18色谱柱 1.7 μm，2.1 mm×100 mm），柱温控制在45℃，流动相为乙腈和水。流速0.3 mL/min，进样量为5 μL。

三重四级杆质谱仪配备的是电喷雾离子源，采用负离子ESI-模式;MRM多反应离子检测模式，去溶剂气和锥孔气都是高纯氮气，毛细管电压为3.0 KV;去溶剂温度为350℃。

1.4 标准曲线、准确度和精密度

称取一定量的氟虫腈及其3个代谢物标准品，用乙腈配置成1 000 mg/L的标准储备液，并依次稀释成1 000.0、500.0、100.0、50.0、10.0、5.0 μg/L的标准工作溶液，按1.2和1.3的条件进行分析，外标法定量，以氟虫腈及其3个代谢物的峰面积（y）为纵坐标，质量浓度（x）为横坐标，绘制标准曲线。

在5～200 μg/kg范围内分别对氟虫腈及其3个代谢物进行3个浓度的添加回收试验，牛奶、鸡蛋和猪肝的添加浓度分别为10、20与200 μg/kg，鸡肉和猪肉分别为5、10和100 μg/kg。且每个添加水平重复5次，用相对标准偏差来验证方法的精密度（RSD）。

2 结果与分析

2.1 检测条件的优化

氟虫腈在高效液相串联质谱上正负离子模式结果表明：氟虫腈及其3个代谢物在ESI-模式和合适的锥孔电压和碰撞能量下具有明显的特征离子峰[M-H]-，选择2个碎片离子峰度和碎片离子数量都较大的离子作为定性离子和定量离子。调节碰撞能量，获得进一步优化的质谱参数（表1）。

2.2 净化剂的选择

因动物源食品基质复杂，提取液中含有较多的脂肪和其他的复杂基质，如果直接进样，可能会导致色谱柱中残留比较多的脂肪和杂质，影响色谱柱的寿命，从而导致其分离效率的降低。再者，质谱部件的锥孔处容易堆积部分脂肪和杂质，致使仪器的灵敏度下降，重复性降低。C18对去除样品中非极性物质和中等极性物质有良好的作用[12]，而弗罗里硅土（florisil）主要是用来去除样品中油脂类物质[13]，多壁碳纳米管一般不成束，具有不同大小和尺寸的孔径结构，碳纳米管的中空纳米结构及较大的比表面积使其具有较多的吸附位点和较强的吸附力[14]。因此本研究中考察了弗罗里硅土（florisil）、C18和多壁碳纳米管（MWCNTs）3种净化剂对其净化的效果。

各种净化剂在5种动物源食品中的净化效果如图2所示，当鸡肉和鸡蛋选择弗罗里硅土，猪肉、牛奶和猪肝选择MWCNTs时能够很好地祛除提取液中的杂质并能取得比较好的净化效果。

2.3 分析方法的线性和基质效应

2.3.1 分析方法的线性

结果表明：氟虫腈及其3个代谢物在5～1 000 μg/L范围内呈现良好的线性关系。氟虫腈的线性方程：y=33.392x+1 159.1，R2=0.993 3;氟甲腈的线性方程为：y=28.584x+1 138.7，R2=0.990 8;氟虫腈硫醚的线性方程为：y=26.096x+756.88，R2=0.991 1;氟虫腈砜的线性方程为：y=63.57x+1 405.6，R2=0.995 1。

2.3.2 基质效应

分别对猪肉、鸡蛋、鸡肉、牛奶和猪肝空白基质进行样品前处理，得到空白基质溶液。用空白基质溶液和乙腈分别配制浓度为10、20、50、100、200和1 000 μg/L的系列基质标准溶液和溶剂标准溶液，以色谱峰面积为纵坐标（y），对浓度（x）绘制做出基质标准曲线和溶剂标准曲线。按如下公式计算基质效应：ME%=（B-A）/B×100%，其中B为溶液标准曲线的斜率，A为基质标准曲线的斜率。当ME%<0时，为基质的增强效应，当ME%>0时，为基质的抑制效应[15]。结果见表2，表明化合物对动物基质均有较大的基质效应，为保证检测结果的真实性，样品分析采用基质标准溶液校正。

2.4 分析方法的准确度、精密度及灵敏度

2.4.1 分析方法的准确度和精密度

氟虫腈及其3个主要代谢物在5种动物源食品中的平均回收率为72.1%～113.8%，相对标准偏差RSD为1.9%～17.6%。结果符合农药残留的标准（表3）。添加回收试验和空白样品的色谱图见图3。

2.4.2 分析方法的灵敏度

用空白样品制取浓度依次为10、20、50、100和200 μg/L的基质加标样品。基于UPLC-MS/MS条件，各化合物的定量离子均能在信噪比的10倍以上，该方法的灵敏度用噪音信号的3倍来表示，得出最低检测限浓度LOD为0.73～1.94 μg/kg，定量限LOQ为5～10 μg/kg。国际食品法典委员会（CAC）规定：氟虫腈及其代谢物在牛奶、猪肝和鸡蛋中的限量值为0.02 mg/kg，在鸡肉和猪肉的限量值为0.01 mg/kg。表4中汇总了线性方程、决定系数、线性范围及检出限。氟虫腈及其代谢物在10～200 μg/kg质量浓度范围内呈良好的线性关系，决定系数（R2）大于0.990 1。

3 方法的应用

试验所用的样品来自河南、北京、新疆、山东、内蒙古、四川、浙江、江苏、宁夏、海南、河北、湖北、云南、黑龙江和广州14个省份共420个样品。对这420个动物源食品进行前处理后用于氟虫腈残留分析。从氟虫腈检测结果（表5）看出，在所有检测的动物源食品中，都没有检出氟虫腈。

4 结论

本文建立了QuEChERS技术结合超高效液相色谱-串联质谱检测5种动物源食品中氟虫腈及其3个代谢物残留的分析方法。氟虫腈及3个代谢产物在5～1 000 μg/L范围内呈现良好的线性关系，氟虫腈的线性方程：y=33.392x+1 159.1，R2=0.993 3;氟甲腈的线性方程为：y=28.584x+1 138.7，R2=0.990 8;氟虫腈硫醚的线性方程为：y=26.096x+756.88，R2=0.991 1;氟虫腈砜的线性方程为：y=63.57x+1 405.6，R2=0.995 1。氟虫腈及其代谢物在5种动物源食品中的平均回收率为72.1%～113.8%，相对标准偏差RSD为1.9%～17.6%，最低检测浓度LOQ为5～10 μg/kg。结果表明方法的灵敏度和精确度均符合實际样品的检测要求。可用作动物源食品中氟虫腈及其代谢物的残留检测。

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（责任编辑： 田 喆）