结直肠癌组织中PCDH7基因启动子甲基化状态及意义

代晨，韩野，高官壮，陈震龙，郭兴坡，周友鑫，匡玉庭

(苏州大学附属第一医院，江苏苏州 215000)

结直肠癌是目前威胁人类健康的主要消化系统恶性肿瘤之一。在世界范围内，结直肠癌已成为第三常见的恶性肿瘤[1,2]。近年来，我国结直肠癌的发病率呈上升趋势[2,3]。外科手术是治疗结直肠癌的最有效手段，但无论是手术治疗、术前新辅助放化疗还是术后放化疗对结直肠癌患者整体生存率的提升效果并不理想，患者的5年生存率仍偏低，多数患者死于肿瘤复发及转移，而结直肠癌的发生发展及复发转移与体内癌基因、抑癌基因表达水平密切相关。表观遗传学是研究基因在核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达出现可遗传变化的一门遗传学分支学科。表观遗传的研究内容包括DNA甲基化、基因组印记、母体效应、基因沉默、核仁显性及RNA编辑等[4]。有研究表明，DNA甲基化在肿瘤的发生发展中有重要作用。抑癌基因启动子区域CpG岛高甲基化导致抑癌基因失活进而与肿瘤的进展、迁移和侵袭密切相关。PCDH7(BH-Pcdh)基因定位于人染色体4p15，作为原钙黏蛋白家族中重要成员，能调节细胞黏附，对胚胎发育过程中的细胞识别、迁移和组织分化及成体组织器官构成有重要作用[5]。近年有研究表明，PCDH7在某些肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。如PCDH7基因高表达与乳腺癌和肺癌的脑转移或骨转移相关[6～9]。然而更多的研究则表明原钙黏蛋白(PCDH)家族在胃、膀胱、肾脏等恶性肿瘤形成过程中起到明显抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡的作用[10～13]。目前有关PCDH7 基因在结直肠癌中的作用及相关分子机制无系统的研究报道。2017年10月～2019年3月，我们探讨了PCDH7基因启动子区甲基化状态与结直肠癌发生发展及患者预后的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集我院普外科2013年1～12月行结直肠癌根治术且经病理切片证实的原发性结直肠癌患者癌组织标本及其相应癌旁正常组织(距肿瘤边缘>5 cm)标本各72例份。患者术前均未行放、化疗及靶向药物治疗且具有完整的临床资料。72例原发性结直肠癌患者中，男45例、女27例，年龄30～81(53.7±8.8)岁。临床病理检查结果显示，高分化6例,中分化21例，低分化35例，未分化10例；Ⅰ期14例，Ⅱ期11例，Ⅲ期23例，Ⅳ期24例；淋巴结转移51例。切除的肿瘤组织及相应癌旁正常组织标本即刻放入液氮中速冻，后放入-80 ℃冰箱保存。患者经手术开始随访至2018年12月。患者或家属均签署知情同意书，且本研究经苏州大学附属第一医院伦理委员会批准通过。

1.2 PCDH7启动子甲基化状态检测 运用甲基化特异性PCR(MSP)检测。使用DNA抽提试剂盒并按照试剂盒的说明提取肿瘤组织及癌旁正常组织中的DNA。之后对DNA进行亚硫酸氢钠的处理。运用urogene网站(http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi)并参照NCBI所给出的DNA序列设计PCDH7的甲基化引物及非甲基化引物，并选择引物1作为后续的研究。甲基化引物(M)：正向引物为5′-TTTTGTTTCGTTATTTAGGTTTCGT-3′，反向引物为5′-AAATTTACTTAATCTTCAACTCGCC-3′；非甲基化引物(U)：正向引物为5′-TTTTGTTTTGTTATTTAGGTTTTGT-3′，反向引物为5′-AAAATTTACTTAATCTTCAACTCACC-3′。以修饰后的DNA为模板使用MSP进行扩增，PCR反应体系为25 μL，包括Taq酶0.2 μL和修饰后的DNA样品2 μL，具体检测及操作步骤按照试剂盒所给说明书进行。反应条件采用95 ℃ 10 min的预变性；95 ℃变性15 s,55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。使用2%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，并采用自动成像仪照相分析。实验重复3次。

1.3 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。PCDH7基因启动子区甲基化情况与患者临床病理特征间的关系使用四格表χ2检验。使用乘积限法(Kaplan-Meier法)估计生存率、绘制生存曲线，比较两组间生存率的差异采用Log-rank趋势检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCDH7基因启动子区域的CpG岛分布及MSP引物的设计 运用在线网站(http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi)对PCDH7基因的启动子区域进行分析并且显示出了CpG岛在其启动子区域的分布情况，同时设计出MSP引物(图1)。

2.2 结直肠癌组织与相应癌旁正常组织中PCDH7基因启动子区甲基化状态 结直肠癌组织中PCDH7基因启动子区甲基化率为58%(42/72)，而癌旁正常组织中PCDH7基因启动子区甲基化率为19%(14/72)，两者比较差异有统计学意义(χ2=22.91，P<0.05)，见图2。

图1 CpG岛在PCDH7启动子区的分布及MSP引物的设计

注：N为正常组织；T为肿瘤组织；Pos为阳性对照；Neg为阴性对照；M为甲基化反应；U为非甲基化反应。

图2 结直肠癌组织和癌旁正常组织中PCDH7基因启动子甲基化状态

2.3 结直肠癌组织中PCDH7基因启动子区甲基化与患者临床病理特征的关系 PCDH7启动子区(CpG岛)甲基化与肿瘤直径、分化程度、淋巴结转移和TNM分期有关(P均<0.05)，与患者性别、年龄无关(P均>0.05)。见表1。

表1 PCDH7基因启动子区甲基化状态与结直肠癌患者临床病理特征的关系(例)

2.4 PCDH7基因甲基化状态与结直肠癌患者预后相关性 对纳入的72例结直肠癌患者随访观察。通过2～60个月的随访观察并且将随访结果数据进行Kaplan-Meier 生存分析,结果表明甲基化患者的5年生存率低于非甲基化患者(P<0.01)，见图3。

图3 甲基化与非甲基化结直肠癌患者生存曲线

3 讨论

表观遗传学是研究基因在核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达出现可遗传变化的一门遗传学分支学科。表观遗传的研究内容包括DNA甲基化、基因组印记、母体效应、基因沉默、核仁显性以及RNA编辑等[4]，其中DNA甲基化是最早发现的一种基因表观修饰的类型。DNA甲基化是指在甲基转移酶的催化下，基因组CpG 二核苷酸胞嘧啶5′碳位上选择性地添加一个甲基基团，形成5′甲基胞嘧啶[14]。在双链DNA分子中，坐落于双螺旋结构主链部分的甲基基团可被甲基化CpG结合域蛋白所识别，接着在DNA复制过程中，位于新合成子链上的未甲基化的CpG岛在DMNT1的作用下甲基化。在DNMT的作用下，胞嘧啶变成5′甲基胞嘧啶，然后5′甲基胞嘧啶在DNA区甲基化酶的作用下转变成5hmC、5fC、5caC，最后胞嘧啶经过TDG/BER介导的碱基修复被重新合成，这就构成了一个完整的循环[15]。在细胞早期发育阶段，细胞的生长及分化依赖于甲基化与非甲基化的交替进行，且这一过程与细胞的正常发育及基因组的稳定密切相关[16]。近年来研究表明，基因甲基化与肿瘤的发生发展密切相关。肿瘤中常存在基因启动子区甲基化水平的降低或异常升高。原癌基因可因基因组整体甲基化水平的降低而活化，抑癌基因可因基因启动子区CpG岛发生异常高甲基化而使其表达明显下调或不表达，而某些基因是信号通路的关键分子，这些基因启动子的异常甲基化可引起该信号通路的激活或失活，上述这些变化均会促进肿瘤的发生[16]。基因甲基化所导致的基因失活在肿瘤发生发展中扮演重要角色[17]。DNA甲基化和基因突变常发生于基因启动子区的CpG岛上，有研究表明异常高甲基化经常发生在癌细胞中的抑癌基因启动子区CpG岛上，抑癌基因启动子区域CpG 岛甲基化程度的增加可明显增加染色体的螺旋程度，从而抑制抑癌基因的表达，而在正常体细胞中这些抑癌基因启动子区的CpG岛上大部分是未甲基化的[18]。基因异常甲基化的发生常在肿瘤发生之前就已存在，并且肿瘤细胞坏死凋亡所产生的DNA可释放到血清、血浆等体液当中，因此检测体液中某些基因的异常甲基化可作为肿瘤早期诊断的有效方法。当然，DNA甲基化对于预测肿瘤患者的预后亦具有重要意义。

钙黏蛋白超家族是一个由多样化的膜相关糖蛋白组成的家族，该蛋白家族有共同的结构特征：由相对较大的胞外结构域和相对较小的胞质结构域组成，这些结构域通过跨膜结构域彼此连接，Ca2+就结合在重复结构域之间，从而赋予钙黏蛋白分子刚性和强度[5]。基于其分子结构，钙黏蛋白超家族可大致分为4类：经典钙黏蛋白、桥粒钙黏蛋白、PCDH及其他种类的钙黏蛋白相关蛋白[19]。PCDH有7个胞外结构域与1个跨膜区和细胞质部分。研究表明，PCDH存在于不同的组织中，他们作为细胞识别分子及信号转导通路中的组成部分而发挥重要作用[5]；PCDH与胚胎时期神经系统的成熟密切相关；亦有研究表明，PCDH与部分神经系统疾病包括认知障碍、自闭症及精神分裂分裂症等病的发生密切相关。近年研究表明，PCDH可影响肿瘤的发生发展，如PCDH17在结直肠癌组织中的表达水平升高后，结直肠癌细胞的增殖能力下降，凋亡增加[20]；此外，有研究表明，在人结直肠癌细胞中，PCDH10基因由于启动子区甲基化而造成其表达水平降低从而导致结直肠癌细胞增殖及迁移能力的提升[21]。

PCDH7作为PCDH家族中重要成员，其mRNA表达主要集中于心脏和脑中，而在甲状腺、胃、胎盘和脊髓中较少[5]，且能调节细胞黏附，对胚胎发育中的细胞识别、迁移和组织分化及成体组织器官构成有重要作用。Lin等[12]研究表明，PCDH7在原发性非肌肉侵袭性膀胱癌中表达水平降低且PCDH7表达水平与原发性非肌肉侵袭性膀胱癌的病理分级、复发及进展密切相关。Chen等[22]研究发现，PCDH7通过影响并改变E-cadherin的表达水平从而抑制胃癌的转移、侵袭及进展。PCDH7在肿瘤中可能发挥了抑癌作用，而其发挥抑癌作用的具体机制在不同肿瘤中却不尽相同。正如Beukers等[23]研究表明，PCDH7在不同年龄段膀胱癌患者中的甲基化率要明显高于正常人，其在结直肠癌中的作用及其可能的分子机制无系统的研究报道。基于上述观点，我们猜测PCDH7 基因很可能作为一种新的结直肠癌候选抑癌基因，并且其启动子区域的高甲基化状态可能是PCDH7 基因在结直肠癌中失活的主要机制之一。

为了验证上述猜测，我们进行了相关研究。本研究结果显示，72例份结直肠癌组织中，42 例份存在PCDH7启动子区甲基化，甲基化率为58%；而癌旁正常组织中PCDH7基因启动子区甲基化率为19%，结直肠癌组织中的PCDH7基因甲基化率明显高于对应的癌旁正常组织，说明PCDH7基因启动子甲基化情况可能与结直肠癌的发生发展密切相关。另外我们发现，PCDH7基因启动子区呈现甲基化状态的结直肠癌患者的肿瘤直径更大、分化程度更低、TNM分期更晚、更易发生淋巴结转移，提示PCDH7基因启动子区域的异常甲基化状态可能促进了结直肠癌的生长、进展和转移。我们还发现，PCDH7基因甲基化的结直肠癌患者5年生存率低于非甲基化患者，差异有统计学意义，提示其可作为判断结直肠癌患者临床预后的一个重要生物学指标。

综上所述，PCDH7基因作为一种抑癌基因在结直肠癌的发生发展中扮演重要角色，其启动子区的异常甲基化与结直肠癌的生长、进展、分化及转移密切相关，可能成为结直肠癌治疗的重要靶标。但由于PCDH7基因的复杂生物学功能，其在结直肠癌发生发展中所起作用是由于单一的启动子区甲基化导致还是同其他多种机制协同导致仍有待进一步研究及阐明，同时本研究的样本数量相对较少，需增加样本量来进一步验证上述结果的准确性及可靠性。