扇贝多糖口服液制备工艺研究

蔡 坤，李文婷，梁志坚，史福林，刘 杨

（汕头大学理学院，广东 汕头 515000）

栉孔扇贝（Chlamys farreri）为海洋软体动物瓣鳃纲贝类，又名海扇，其营养丰富，肉质鲜美可口，具有很高的食用价值.有资料表明扇贝含有丰富的蛋白质、糖类脂肪、维生素、微量元素等营养成分[1-5]，每100 g 扇贝瑶柱中含蛋白质63.7 g、脂肪3 g、糖类15 g、钙47 mg、磷886 mg 和铁2.9 mg 等[6]，其中糖类含量丰富，仅次于蛋白质含量.研究还发现，扇贝中的多种生物活性成分，具有很高的药用和保健价值.其中多糖是扇贝生理活性物质的主要组成部分，具有抗肿瘤、抗氧化、增强机体免疫能力、抗病毒等多种生理功能[7-13]，对扇贝多糖的研究将为扇贝的高值化利用提供依据，因此扇贝多糖口服液开发具有十分广阔的商业应用前景.

本研究主要通过微波辅助热水浸提法提取扇贝粗多糖，利用双水相体系、透析技术纯化，真空干燥后得粗多糖干粉.利用所得的多糖进行吞噬细胞吞噬和活化实验，以探究其免疫活性.再将提取所得多糖与白砂糖、柠檬酸、蜂蜜共同调配成口服液.制备过程中以多糖得率和感官评定分数为指标，分别考查扇贝多糖的提取方法和口服液配方组成等因素，优选扇贝多糖提取工艺及口服液制备配方，为扇贝的进一步开发和利用提供参考.

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

1.1.1 实验材料

实验用扇贝瑶柱由江苏连云港洋溢海鲜馆提供，取自栉孔扇贝（Chlamys farreri）.在50°C下烘干，研磨成扇贝干粉后备用.

扇贝粗多糖（CFP）：按微波功率650 W、微波提取时间15 min、微波温度50℃及液料比60∶1 的条件处理扇贝干粉，提取液经双水相体系、透析技术纯化后冷冻干燥后备用.用于细胞试验的试样溶液均在临用前用细胞培养液配制，经0.22 μm 滤膜过滤除菌，备用.

RAW 264.7 细胞株来自武汉普诺赛科技有限公司，磷酸缓冲盐溶液（PBS）、脂多糖（LPS）购于北京索莱宝科技有限公司，DMEM 高糖培养基、胎牛血清（FBS）、胰酶消化液、青-链霉素双抗均购于Gibco 公司，二甲基亚砜（DMSO）购于麦克林公司，硫酸铵、无水乙醇为分析纯，均购于国药集团化学试剂有限公司；透析袋（截留分子量：2000 g/mol）购于美国Spectrum laboratories 股份有限公司；柠檬酸、白砂糖、蜂蜜均为食用级.

1.1.2 实验仪器

CW-2000 型超声-微波协同萃取仪（上海新拓分析仪器科技有限公司）；RE-52AA型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；DK-S12 型电热恒温水浴锅（上海森信实验仪器有限公司）；二氧化碳培养箱（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；M200 Pro 光栅型多功能酶标仪（瑞士Tecan 公司）；37XC 型倒置显微镜（上海光学仪器厂）；BCM-1300 生物洁净工作台（安泰空气技术有限公司）；MLS-3750 高压蒸汽灭菌锅（三洋电机株式会社）；DK-S12 型电热恒温水浴锅（上海森信实验仪器有限公司）；BCD-196T 冰箱（青岛海尔股份有限公司）.

1.2 方法

1.2.1 扇贝粗多糖的制备

1.2.1.1 超声微波辅助热水浸提扇贝粗多糖的条件优化

超声-微波协同萃取仪主要由加热装置、超声发生装置、微波发生装置、冷凝装置、反应器（球型玻璃烧瓶）组成.反应器体积可达1000 mL.

将样品粉末与蒸馏水按一定液料比配置于反应器中，然后将反应器置入萃取仪中，调节好萃取仪微波功率、微波时间、微波温度的参数后，运行萃取仪.待萃取过程完成后取出萃取液，待进一步操作.

具体工艺参数设置如下：

（1）固定液料比为60∶1、微波时间为15 min 及微波温度为50°C，考察不同微波功率（350、450、550、650 和750 W）对扇贝多糖得率的影响；

（2）固定液料比为60∶1、微波功率为650 W 及微波温度为50°C，考察不同微波时间（5、10、15、20 和25 min）对扇贝多糖得率的影响；

（3）固定液料比为60∶1、微波功率为650 W 及微波时间为15 min，考察不同微波温度（40、50、60、70 和 80°C）对扇贝多糖得率的影响；

（4）固定微波功率为650 W、微波时间为15 min 及微波温度为50°C，考察不同液料比（40∶1、50∶1、60∶1、70∶1 和 80∶1）对扇贝多糖得率的影响.

用葡萄糖制备标准溶液，通过苯酚-硫酸法[14]测定吸光值后绘制标准曲线，得到线性回归方程，再利用线性回归方程计算提取的扇贝溶液中的多糖得率.以扇贝多糖得率为指标，绘制关于微波功率、提取时间、提取温度和液料比的单因素实验图，优选出多糖提取条件.

1.2.1.2 获取脱蛋白的扇贝多糖干粉

将经不同微波辅助热水浸提后的样品液倒入旋转蒸发器的烧瓶中，蒸发浓缩至40 g，然后配置乙醇-硫酸铵双水相体系（400 g 体系：硫酸铵177.0 g、乙醇：109.2 g、蒸馏水73.8 g、样品液40 g），将配置好的溶液混匀后倒入分液漏斗静置分层，取下层清液，经透析后再进行冷冻干燥.

1.2.2 扇贝多糖的体外免疫活性研究

1.2.2.1 中性红法测定RAW 264.7 巨噬细胞的吞噬能力

取生长良好、对数生长期的RAW 264.7 巨噬细胞，吸去培养液，加入2 mL 预热的PBS 清洗残留的培养液，重复两次，然后用冷的PBS 进行处理，2 min 后进行吹打，制成浓度为1×105个/mL 的细胞悬液，接种在无菌的96 孔细胞培养板中，每孔加入100 μL，在5%CO2、37 ℃的培养箱中贴壁培养12 h，待细胞贴壁后，吸弃培养液，用预热的PBS 洗去未贴壁的细胞，分别加入100 μL 培养液（含10% FBS）和不同浓度CFP（125-2000 μg/mL），以 LPS（5 μg/mL）为阳性对照.

细胞培养24 h 后，在无菌环境下，吸弃细胞培养液，每孔加入无菌0.075%的中性红生理盐水溶液100 μL，继续培养20 min，吸去中性红溶液，每孔用PBS 小心洗涤两次，吸去PBS 后每孔加入200 μL 的细胞裂解液体积比φ（冰醋酸：无水乙醇）=1∶1，提取出细胞内的中性红，室温静置过夜，用酶标仪在540 nm 处检测吸光值.每次实验重复三次.

1.2.2.2 Griess 法测定RAW 264.7 巨噬细胞的NO 分泌量

NO 在体内或者在水溶液中极易氧化成NO2-，在酸性条件下，NO2-与重氮盐磺胺发生重氮反应，后者进一步与萘基乙烯己二胺发生偶合反应，该反应的终产物浓度与NO2-浓度具有线性关系，在540～570 nm 处具有最大吸收峰.

细胞浓度和加药方式同1.2.2.1（但将加药体积改为200 μL）.细胞分别培养24 h 后，离心（170xg，10 min），收集培养液上清，按试剂盒说明书（Griess 法）制作标准曲线，测定NO 含量.

1.2.3 优选扇贝多糖口服液配方

1.2.3.1 口服液制备单因素实验

按1.2.1 实验操作中筛选的提取条件提取出扇贝多糖，与白砂糖、柠檬酸和蜂蜜加水混合制备成口服液，并进行感官评定.以感官评定分数为指标，优选出扇贝多糖口服液的配方.具体调配操作如下：

（1）取扇贝多糖粉，配制成质量分数为0.1%、0.6%、1.1%、1.6%和2.1%扇贝多糖溶液各100 mL，分别向溶液中加入质量分数达到2%白砂糖、0.12%柠檬酸、1.5%蜂蜜，配置成扇贝多糖口服液，对其进行感官评价（选用百分制），确定最佳扇贝多糖用量；

（2）在最佳扇贝多糖用量的基础上，添加白砂糖，质量分数分别达到1%、2%、3%、4%和5%，随后添加质量分数为0.12%柠檬酸、1.5%蜂蜜，配置成扇贝多糖口服液，对其进行感官评价，确定最佳白砂糖用量；

（3）在最佳扇贝多糖和白砂糖的基础上，柠檬酸质量分数达到0.02%、0.07%、0.12%、0.17%和0.22%，然后各加入蜂蜜，质量分数达到1.5%，配置成扇贝多糖口服液，对其进行感官评价，确定最佳柠檬酸用量；

（4）在上述单因素实验的基础上，扇贝多糖，白砂糖，柠檬酸都分别选用其最佳用量.添加蜂蜜，质量分数达到0.5%、1%、1.5%、2%和2.5%，配置成扇贝多糖口服液，对其进行感官评价，确定最佳蜂蜜用量.

1.2.3.2 评分标准

为使制得的口服液具有较好的感官品质，将制备好的扇贝多糖口服液分别请10 名具有一定经验及鉴别能力的不同品尝者进行感官评定.总得分选用百分制，每个指标最高25 分，评分标准见表1（总分计算方法：去除一个最高分和一个最低分后，计算剩余得分的平均值，结果保留整数）.

表1 口服液评分标准

2 结果与分析

2.1 优选微波辅助热水浸提法条件

利用超声-微波协同萃取仪进行微波辅助热水浸提时有4 个重要的工艺参数：微波功率、微波提取时间、微波温度及液料比.因此本实验以多糖得率为依据，对这4 个参数分别进行单因素实验，以期寻找到最佳的提取条件.实验结果如图1.

图1（A）图是固定液料比为60∶1、微波时间为15 min 及微波温度为50°C，考察不同微波功率（350、450、550、650 和750 W）对扇贝多糖得率的影响.从图中可以明显观察到，当功率在350～650 W 之间时，多糖得率随功率增加而增大，但功率超过650 W 后多糖得率开始明显下降.因此，得出扇贝多糖微波辅助热水浸提的最佳微波功率应为650 W.

图1（B）图是固定液料比为60∶1、微波功率为650 W 及微波时间为15 min，考察不同微波时间（5、10、15、20 和25 min）对扇贝多糖得率的影响.从图中可以看出在5～15 min 间，多糖得率随提取时间增长而增加，但15～20 min 多糖得率却开始缓慢下降，超过20 min 多糖得率下降明显.因此，扇贝多糖微波辅助热水浸提的最佳微波提取时间应为15 min.

图1（C）图是固定液料比为60∶1、微波功率为650 W 及微波时间为15 min，考察不同微波温度（40、50、60、70 和80 ℃）对扇贝多糖得率的影响.从图中可以看出40～50 ℃时，多糖得率随温度上升而增加；但50～60 ℃之间，多糖得率随温度上升而逐渐降低；当温度在60～70 ℃之间时，多糖得率又有小幅度增高；而随着温度继续上升，多糖得率开始大幅度下降.因此，扇贝多糖微波辅助热水浸提的最佳微波温度应为50 ℃.

图1（D）图是固定微波功率为650 W、微波时间为15 min 及微波温度为50℃，考察不同液料比（40∶1、50∶1、60∶1、70∶1 和80∶1）对扇贝多糖得率的影响.从图中看，当液料比为60∶1 时，多糖得率明显高于其他条件下的多糖得率.因此，扇贝多糖微波辅助热水浸提的最佳液料比应为60∶1.

综上所述，要想利用微波辅助热水浸提法获得较高的多糖得率，应对工艺参数进行如下选择：微波功率650 W、微波提取时间15 min、微波温度50℃及液料比60∶1.

图1 微波功率、微波提取时间、微波温度和液料比对扇贝多糖得率的影响

2.2 扇贝多糖的体外免疫活性研究

2.2.1 中性红法测定RAW 264.7 巨噬细胞的吞噬能力

作为机体非特异性免疫系统的重要组成细胞，巨噬细胞承担着吞噬、消除细胞内寄生菌、真菌，和清除衰老的自身细胞的职能，所以巨噬细胞的吞噬功能，在一定程度上可以反映机体的免疫状态.本实验中采用巨噬细胞吞噬中性红的方法对RAW 264.7 巨噬细胞的吞噬能力进行测定，结果如图2所示.

由图可知，当作用时间为24 h 时，LPS 组和粗多糖组的吸光值较空白对照组均有着不同程度的升高，表明经过LPS 和粗多糖处理后，巨噬细胞RAW 264.7 吞噬中性红的能力得到了提高.

图2 扇贝粗多糖（CFP）对RAW264.7 细胞吞噬中性红的影响（24 h）与对照组比较：*p＜0.05，**p＜0.01.

2.2.2 Griess 法测定RAW 264.7 巨噬细胞的NO 分泌量

探讨前，首先介绍一下曲字的调值和音乐性字腔的一些基本情况。汉语口语中的字声有四声阴阳之别，但在音乐性的昆曲字腔中，除了平声字的字腔外，其他三声字腔的阴、阳，几乎没有差别。其中，上声字字腔音势就只有呈状的高—低—高一种；去声字字腔音势就只有呈状的低—高—低一种；入声字字腔音势就只有呈▼顿音状的一个单短音。概言之，这就是昆曲音乐的一大基本特征：仄声字腔不分阴阳。这一点，与昆曲的曲词创作只讲平仄、不分四声阴阳基本对应。

NO 作为信使分子和细胞毒性分子，广泛的参与集体免疫应答相关的各种生理过程，是活化的巨噬细胞杀伤肿瘤细胞和病原微生物的主要效应分子，所以NO 的分泌量可以作为检测巨噬细胞活化状态的一个指标[15].

本实验选用 5 个质量浓度梯度（125 μg/mL，250 μg/mL，500 μg/mL，1000 μg/mL，2000 μg/mL）的三种多糖对巨噬细胞RAW 264.7 刺激24 h，收集细胞培养上清，以PBS 组为空白对照，LPS（5 μg/mL）为阳性对照.以NaNO2为标准品制作标准曲线，得到图3，并从图中计算得NO 标准曲线线性回归方程为y=0.0058x，R2=0.9993，再根据线性回归方程计算得各实验组的NO 浓度，结果如图4（24 h）.

如图4所示，在粗多糖处理组中，多糖质量浓度在250～2000 μg/mL 范围内显著的促进了巨噬细胞RAW 264.7 分泌NO，而且呈现了浓度依赖性.

图3 NO 标准曲线

图4 扇贝粗多糖（CFP）对 RAW 264.7 细胞分泌 NO 的影响（24 h）与对照组比较：*p＜0.05，**p＜0.01.

2.3 优选扇贝多糖口服液配方

2.3.1 多糖用量对口服液品质的影响

如表2所示，制备口服液时，随着扇贝多糖添加量的增多，口服液的色泽由无色变为浅黄色，状态也由透明澄清变成半透明，但对于口服液的香味和口感不会产生明显影响.从色泽和状态角度，多糖含量为1.6%和2.1%呈浅黄色半透明的口服液给人的感官感受优于多糖含量为0.1%～1.1%无色透明的口服液，又因为多糖含量为1.6%和2.1%的口服液在香味和口感上无明显差异，基于成本考虑，扇贝多糖含量1.6%为最适用量.

表2 扇贝多糖对口服液品质的影响

2.3.2 白砂糖和柠檬酸用量对口服液品质的影响

如表3和表4所示，综合考虑选择白砂糖质量分数3%，柠檬酸质量分数为0.07%.

表3 白砂糖对口服液品质的影响

表4 柠檬酸对多糖口服液品质的影响

2.3.3 蜂蜜用量对口服液品质的影响

蜂蜜的添加使扇贝多糖口服液滋味更丰富，营养价值也有所提高.但蜂蜜的用量对口服液的组织状态，口感，香味等指标影响较大，因此，筛选蜂蜜用量应更加谨慎.

如表5所示，当蜂蜜含量为1%时，多糖口服液酸甜适中，清新爽口；当蜂蜜含量超过2%时，口服液组织状态受蜂蜜影响开始变浓稠，口感偏甜，因此，选用蜂蜜质量分数为1%为佳.

表5 蜂蜜对多糖口服液品质的影响

2.3.4 小结

根据上述成分的最佳用量（即以质量分数记，扇贝多糖为1.6%、白砂糖为3%、蜂蜜为1%、柠檬酸为0.07%）配置扇贝多糖口服液，蜂蜜香味浓郁，酸甜适中，呈浅黄色半透明状，经感官评分为85，因此适合作为制备口服液的配方.

3 结论

本实验采用微波辅助热水浸提的方法提取扇贝多糖，研究了不同提取条件对扇贝多糖得率的影响，并在此基础上选择合适的提取条件.通过对微波功率、提取时间、提取温度及液料比进行的单因素实验的结果分析，最终选择在微波功率650 W、微波提取时间15 min、微波温度50℃及液料比60∶1 的条件下对本实验所用的扇贝瑶柱材料进行提取.

根据细胞实验的结果可知，扇贝多糖浓度在125-2000 μg/mL 范围内可以促进巨噬细胞RAW 264.7 吞噬中性红的能力，浓度在250-2000 μg/mL 范围内能促进巨噬细胞RAW 264.7 分泌NO 且呈浓度依赖性.

在调配扇贝多糖口服液的过程中，通过对扇贝多糖、白砂糖、蜂蜜和柠檬酸4 种成分的单因素实验的研究，得出适宜的口服液配方（以质量分数记）：扇贝多糖为1.6%、白砂糖为3%、蜂蜜为1%、柠檬酸为0.07%.

本试验制备的扇贝多糖口服液清香爽口、食用方便，但还需通过动物实验及临床实验来验证其药用价值，这也是下一步需要研究的方向.