气肿疽NanA基因真核表达质粒的构建与鉴定

马玉腾， 罗永仁， 姜永越， 于成东， 张 皓， 金 鑫*

(1.延边大学农学院，吉林 延吉 133000；2.珲春边境经济合作区综合服务站，吉林 珲春 133315；3.图们市农业农村局畜牧管理总站，吉林 图们 133000；4.敦化市民政局，吉林 敦化 133700)

气肿疽(Clostridium chauvoei) 是一种主要侵袭于反刍动物的急热性、败血性传染病，形状为呈梭状或汤勺状的革兰氏染色阳性杆菌[1]，动物感染后主要表现为暴发性肌坏死，通常会在短时间内死亡，由于死亡率极高，为畜牧业生产带来了重大损失[2-3]。其致病因子为气肿疽梭菌，在全球范围内广泛传播，发病迅速，死亡率高[4-5]。该病的传染源主要是病畜，传递途径是土壤。当动物采食或口鼻接触土壤时，芽孢能够通过呼吸道或消化道进入组织，同时体内的厌氧条件能够促进芽孢萌发、繁殖和外毒素的产生[6-7]。动物采食被这种土壤污染的饲料和饮水，经口腔和咽喉创伤侵入组织，也可由松弛或微伤的胃肠粘膜侵入血流而感染全身[8]。一直以来，该病被认为只感染反刍动物，但2007年以来却出现了该病引发人气性坏疽和结肠炎而死亡的2例报告[9]，在过去10年中该病迅速成为全球学者的研究热点。

疫苗的使用是疾病免疫的重要手段，而气肿疽缺乏经济有效的治疗方法，因此气肿疽疫苗的研发就尤为重要。传统疫苗产量小，保护性差，因此核酸疫苗、蛋白质亚单位疫苗等疫苗的研发和推广具有广阔的前景[10-11]。在气肿疽梭菌众多毒力因子中，气肿疽梭菌NanA基因具有重要研究价值。本试验构建了气肿疽NanA基因的真核表达质粒，以探索真核表达质粒作为核酸疫苗的可能性，为气肿疽核酸疫苗的研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试验菌株及试剂

pMD18-T Simple Vector购于TaKaRa宝生物工程有限公司，pVAX1载体由延边大学预防兽医实验室保存备用，鼠抗气肿疽梭菌NanA蛋白由延边大学预防实验室制备；延边株气肿疽梭菌由延边地区病牛病料采集，分离鉴定并纯化后于延边大学动物医学系预防实验室保存[12]；限制性内切酶、Ex Taq DNA聚合酶、dNTP、T4 DNA连接酶，购自TaKaRa公司；凝胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒，均购自OMEGA有限公司；其他试剂均为国产级分析纯。

1.2 引物设计与合成

根据NCBI上气肿疽梭菌JF4135菌株NanA基因序列(GenBank号：FM213082.1)，通过Primer Premier 5.0设计了1对特异性引物用于气肿疽梭菌真核表达质粒的构建。上游引物添加BamHI 酶切位点及Kozak序列(GCCACCATGGAA)，下游引物添加XhoI酶切位点及终止密码子，该引物由上海生工生物工程股份有限公司合成(表1)。

表1 引物序列

1.3 延边株气肿疽梭菌DNA的提取与NanA基因的扩增

使用酚—氯仿抽提法提取延边株气肿疽梭菌DNA并分别以F1、F2为引物扩增NanA基因。

PCR反应体系：延边株气肿疽梭菌DNA 2.0 μL、dNTP2.0 μL、10×ExTaqBuffer2.5 μL、F1/F2 1.0 μL、ExTaq0.25 μL、dd H2O 16.25 μL，总体系为25 μL。

PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s、61 ℃退火45 s、72 ℃延伸1 min 30 s，35个循环；72 ℃再延伸10 min；4 ℃保存。将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像仪观察扩增结果。

1.4 气肿疽梭菌NanA基因的克隆与鉴定

将经PCR扩增的目的片段NanA基因与pMD18-T Simple Vector混合，4 ℃过夜进行连接，将连接产物加入到Trans 5α感受态细胞中混合进行转化，提取重组质粒pMD 18-T-NanA，以重组质粒pMD 18-T-NanA为模板，利用上述引物进行鉴定。

1.5 重组质粒pVAX1-NanA的构建及鉴定

将pMD 18-T-NanA和pVAX1菌种分别接种于Amp+抗性和Kan+抗性的液体LB中，37 ℃，200 r/min震荡培养12～16 h。对pMD 18-T-NanA及pVAX1质粒进行提取，将提取质粒用BamHⅠ、XhoⅠ进行双酶切。将上述纯化回收得到的NanA目的基因片段与真核表达质粒pVAX1片段连接转化至Trans 5α感受态细胞中，提取重组质粒pVAX1-NanA并进行鉴定。将PCR和双酶切鉴定均为阳性的重组pMD 18-T-NanA质粒送往上海生工生物工程有限公司进行测序。

2 结果与分析

2.1 NanA基因的扩增

以F1、F2为引物，纯化的气肿疽梭菌DNA为模板，经PCR扩增得到NanA目的基因片段，大小为1 950 bp，与预期大小相同(图1)。

M：DL 2 000 DNA Marker；1：水对照；2：NanA基因的PCR扩增产物

2.2 重组质粒pMD 18-T-NanA的PCR及双酶切鉴定

以F1、F2为引物， pMD 18-T-NanA质粒为模板，进行PCR鉴定，扩增得到1 950 bp大小的目的片段，PCR鉴定结果见图2。

M：DL 5 000 DNA Marker；1～2：pMD 18-T-NanA PCR鉴定产物

将PCR初步鉴定为阳性的pMD 18-T-NanA质粒，用BamHⅠ、XhoⅠ进行双酶切鉴定[13-14]，得到了大小分别为2 692 bp和1 950 bp的2条目的片段，表明获得了大小相符的重组质粒pMD 18-T-NanA，双酶切的鉴定结果见图3。

M: DL 5 000 DNA Marker；1～4：pMD 18-T-NanA双酶切鉴定产物

2.3 重组质粒pVAX1-NanA的PCR及双酶切鉴定

以F1、F2为引物，以pVAX1-NanA质粒为模板进行PCR鉴定，扩增得到1 950 bp大小的目的片段，PCR鉴定结果见图4。

M：DL2 000 DNA Marker；1：pVAX1-NanA PCR鉴定产物

将PCR初步鉴定为阳性的重组质粒pVAX1-NanA，用BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切鉴定，得到了分别为2 999 bp和1 950 bp大小的2条目的片段，双酶切的鉴定结果见图5。

M：DL5 000 DNA Marker；1-5：pVAX1-NanA质粒双酶切鉴定产物

2.4 NanA基因核苷酸同源性比对

同源性比对分析结果表明：气肿疽梭菌延边株NanA基因与NCBI公布的JF4135(GenBank登录号FM213082.1)菌株序列相比共有3处点核苷酸突变，分别于NanA基因第198位由T突变为C、第778位由A突变为G、第1261位由A突变为G。比对显示核苷酸序列的同源性均为99.8%(图6)。

3 讨论与结论

气肿疽在全球范围内流行，在发达国家和发展中国家分布较广泛，动物感染后主要表现为暴发性肌坏死，通常会在短时间内死亡，由于死亡率极高，使得该病成为畜牧业经济损失的重要原因[14-15]。气肿疽梭菌病原体一般通过芽胞状态侵入肌体, 在具有一定腐败物的无氧肠腺内进行出芽繁殖, 可经淋巴与血液循环进行散播, 并在肌肉与肝组织内长期潜伏, 肌体肌肉群受伤或出现变化后, 就为病原体的繁育提供较合适的条件[16]。我国最早的气肿疽疫苗以带有病原体的组织液为材料制作活性疫苗，但活性疫苗可能无法提供对抗该病的最佳免疫反应即细胞免疫，目前国内使用最广泛的是气肿疽灭活疫苗，但很多临床报告和报道指出该病的发生仍然普遍存在[17]。

气肿疽其主要毒力基因为细胞毒素CctA、唾液酸酶NanA和透明质酸酶NagI、透明质酸酶NagH等。唾液酸酶又称为神经氨酸酶，能够水解寡糖、糖醛酸苷、糖蛋白和糖脂中的末端唾液酸残基和甘氨酸残基，从而影响细胞内基质并能够破坏宿主免疫调节的通路[18]。由于其通过裂解唾液酸而在发病过程中起重要的作用，被认定为一种重要的毒力因子[19-20]。神经氨酸酶由气肿疽梭菌NanA基因编码，基因序列全长为2 519 bp，其分子质量为81 kDa，编码772个氨基酸，其主要功能区在第193～771个氨基酸之间。中央的高变区对于神经氨酸酶的真核疫苗构建是至关重要的，因此该试验扩增的部分选取了该段的1 950 bp片段。将克隆后测序得到的气肿疽梭菌NanA基因核苷酸序列与NCBI中发布的JF4135菌株(GenBank登录号：FM213082.1)序列进行同源性比对，并发现了3处点突变。分别于NanA基因第198位由T突变为C、第778位由A突变为G、第1261位由A突变为G。其核苷酸序列的同源性均为99.8%。该试验采用pVAX1作为真核表达载体，该载体在肿瘤疾病、循环系统疾病、神经系统疾病、传染性疾病等的防治方面皆有应用。段雪岩、张永佳以pVAX1为载体，分别构建了真核表达质粒pVAX1-CctA和pVAX1-FliA并在Vero细胞中表达[21-22]，结合该研究结果，综合分析真核表达质粒pVAX1-CctA和pVAX1-FliA的免疫效果，未来可进一步进行气肿疽梭菌其他基因真核表达的探究。由于CctA基因能够参与溶血和细胞毒性作用，FliA基因能够促进细菌移动从而促进感染过程，NagI能够影响细胞内基质和组织的正常生理机制，破坏肌肉周围疏松结缔组织，NanA基因能够影响细胞内基质并破坏宿主免疫调节的通路。针对不同毒力基因的特性与作用，利用多种基因共同诱导个体免疫有较好的研究前景，目前国内已有针对于多种传染病的多价苗，能够使个体得到完全的免疫保护作用。

该试验以气肿疽NanA基因为基础，构建了pVAX1-NanA真核表达质粒并进行了鉴定。为气肿疽梭菌NanA基因的进一步探究提供了依据，为气肿疽核酸疫苗的研究奠定了基础。

图6 NanA基因核苷酸同源性比对