高通量测序技术检测非典型子宫内膜增生疾病微小RNA 的差异表达

唐世倩 褚春芳 李 婷 郑 萍 周 琦 刘菊红 王 玉

首都医科大学附属北京妇产医院妇科，北京 100026

非典型子宫内膜增生（atypical endometrial hyperplasia，AEH）疾病被认为是子宫内膜癌的癌前病变，在雌激素持续作用下，最终可进展为子宫内膜癌[1]，目前AEH 的发病机制并不完全清楚。大量研究发现，AEH 疾病存在着多种基因的异常表达，提示AEH 是由多种基因共同参与的、复杂的生物演变过程[2]。

微小RNA（microRNA，miRNA)是一种小分子RNA，它可通过影响目标mRNA 的稳定性及翻译，参与细胞周期、分化、生长、新陈代谢等多个生物过程的调控[3]，现已证实多种miRNA 参与机体内肿瘤的形成，并发挥巨大调节作用，但其在AEH 中的作用目前尚不清楚。为了探索miRNA 在AEH 中的作用，本研究采用高通量测序技术筛选正常人群与AEH 患者子宫内膜的差异miRNA，并进行生物学分析，了解差异miRNA 在AEH 中作用及机制。

1 对象与方法

1.1 研究对象

收集2016 年1 月～2017 年1 月在首都医科大学附属北京妇产医院（以下简称“我院”）就诊的3 例AEH患者（实验组）及3 名正常女性（对照组）的子宫内膜组织标本，年龄25～40 岁。实验组平均年龄（36.33±1.86）岁，平均体重指数（BMI）（24.31±1.42）kg/m2；对照组平均年龄（30.00±2.89）岁，平均BMI（18.25±1.36）kg/m2。两组年龄、BMI 比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。

实验组样本选自经诊断性刮宫术，术后病理证实为AEH 内膜组织的患者；对照组样本选自同期行诊断性刮宫术，术后病理证实为正常增生期子宫内膜的女性。所有研究对象既往均未使用激素药物治疗，且无甲状腺、子宫肌瘤、恶性肿瘤、糖尿病、多囊卵巢综合征等病史。所有研究对象均签署知情同意书，本研究经我院医学伦理委员会批准。

1.2 研究方法

用生理盐水洗涤两组诊断性刮宫术后得到的内膜组织标本，置EP 管中，液氮快速冷冻后，-80℃冰箱保存待测。根据术后病理结果挑选符合要求的组织标本，将实验组与对照组配对。

1.2.1 总RNA 提取及文库构建 总RNA 提取及文库构建由深圳华大基因科技有限公司完成。取适量组织样品研磨后，加1.5 mL TRIzol 裂解液，放入组织研磨机（TissueLyser Ⅱ）中研磨30 s，使组织细胞充分裂解，12000 g 离心5 min（4°C），取上清液，抽提纯化样品的总RNA。采用安捷伦2100 芯片生物分析仪（Agilent 2100 Bioanalyzer）评估总RNA，NanoDrop Lite分光光度计(赛默飞世尔科技公司)检测A260/A280 的总RNA 纯度。将检验合格的总RNA 采用small RNA文库构建试剂盒TruSeq Small RNA Library Prep Kit（illumina，货号：RS-200-0012）进行文库构建。取200～1000 ng RNA 样品，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离不同大小的RNA 片段，收集18～30 nt 之间的RNA条带。根据small RNA 文库构建试剂盒在RNA 3′、5′端接上接头，通过与3′端互补的逆转录引物反转录为cDNA，反应条件：70℃2 min，50℃1 h。PCR 扩增程序：98℃30 s；98℃10 s，60℃30 s，72℃15 s，11 个循环；72℃10 min；4℃保持。使用PAGE 对PCR 产物切胶回收纯化，回收产物溶于溴化乙锭（EB）中，构建small RNA 文库。采用Agilent 2100 Bioanalyzer 检测small RNA 文库，经测序平台（Illumina HiSeq-4000）对该文库进行高通量测序。

1.2.2 miRNA 信息分析 处理原始数据：过滤低质量读数，如去除长度小于18 nt 的片段、去除5′和3′端口质量连续低于10 的碱基及含有＞10% N 碱基的读数等。将处理后的序列运用序列拼接工具bowtie 定位到人类基因组，通过对比分析，去除与基因组不匹配的序列。再将匹配序列分别与基因组重复序列Gen-Bank 数据库和Rfam 10.0 数据库进行对比，筛选和去除其他小分子RNA 序列，剩余序列应用Blast 和miRbase 21.0 数据库比对，鉴定已知的miRNA。对存在于人类基因组外显子反义链、内含子、基因间区，但未确定的sRNA 而言，通过Mirdeep 筛选miRNA 的生物特征得到新的miRNA，将鉴定出已知和预测的新miRNA 用于后续分析。

1.2.3 已知miRNA 差异表达分析 应用DEGseq 软件对已知的miRNA 进行表达分析，阈值为|log FC|＞2、qvalue＜0.001，筛选出有显著性差异的miRNA。对差异表达的miRNA 进行Venn 分析，筛选3 组或2 组间有交集的miRNA 作为差异表达，进入下游分析。

1.2.4 miRNA 的功能分析 用miRWalk 2.0、miRanda、PITA、RNAhybrid 和Targetscan 数据库预测miRNA 的靶基因，使用R 包clusterprofiler 进行KEGG 富集分析。使用BH（Benjamini 和Hochberg）法校正P 值，以P＜0.05 为截止值。

1.2.5 miRNA 之间相互作用 若两miRNA 共同调控同一靶基因，则该靶基因为两miRNA 共调控靶基因，对共同调控的靶基因进行GO Biological Process 富集分析，并根据富集到的条目数量来量化miRNA 之间功能协同作用。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（）表示，两组间比较采用t 检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 small RNA 文库表达情况

实验组和对照组经高通量测序分别得到45 446 485 和46 115 154 条原始序列，数据处理后，得到的序列分别为44 418 630 及45 097 769 条。

2.2 miRNA 及相应靶基因情况

通过软件分析及比对，实验组得到284 个已知miRNA 及1925 个新miRNA；对照组得到409 个已知miRNA 及2314 个新miRNA，进一步通过数据库预测其相应的靶基因。见表1。

表1 miRNA 及相应靶基因情况

2.3 差异miRNA 分析

结果显示，在阈值为|log FC|＞2，qvalue＜0.001的条件下，得到3 组（346、66、11 个）差异miRNA，下游分析共获得18 个miRNA，其中17 个为上调miRNA，包括：hsa-miR-375、hsa-miR-1307-5p、hsa-miR-671-3p、hsa-miR-1247-5p、hsa-miR-340-3p、hsamiR-100-3p、hsa-miR-345-5p、hsa-miR-3909、hsamiR-431-5p、hsa-miR-1247-3p、hsa-miR-4454、hsamiR-182-5p、hsa-miR-4286、hsa-miR-577、hsa-miR-455-3p、hsa-miR-183-5p、hsa-miR-4485；1 个为表达下调miRNA，hsa-miR-3609。

2.4 差异miRNA 靶基因的富集分析

每个miRNA 的靶基因功能富集和通路分析结果见图1（封四），富集因子点越大表示富集程度越高，通路中候选靶基因个数越多。

图1 差异miRNA 靶基因的富集分析

2.5 差异miRNA 共调控靶基因网络图

结果显示，miRNA 之间共调控靶基因共有18 个节点，107 个关系对。miR-4286、miR-577、miR-182-5p 等miRNA 之间有较多、紧密的功能协同作用，分别调控1493、3455、2864 个靶基因，共同调节CACNA1C、MECP2、FOXK1、LPP、SH3TC2、Smad、MDM4 等靶基因，见图2。直线代表两miRNA 之间的共调控靶基因存在显著的GO Biological Process 富集结果，其粗细代表富集结果数目。

图2 差异miRNA 共调控靶基因网络图

3 讨论

近年来，AEH 的发病率呈上升趋势，越来越受关注。临床上对无生育要求的AEH 患者可行全子宫切除术，但对于有生育要求的女性而言，可连续服用大剂量、高效的孕激素[4]或选择放置左炔诺孕酮宫内缓释系统（LNG-IUS）[5]抑制内膜增生，同时口服二甲双胍等[6]辅助治疗，但是部分患者的治疗效果并不满意。随着人们对疾病逐渐深入了解，认识到AEH 不仅是肿瘤相关性疾病，而且还与机体糖耐量降低、糖尿病、中心性肥胖、内分泌异常等多种代谢异常疾病相关。

miRNA 是一类包含19～25 个碱基的内源性RNA，主要通过与靶基因mRNA 的3′-非翻译区（3′-UTR）结合，调节mRNA 相关靶基因，影响细胞的增殖、分化、凋亡及个体发育。miRNA 具有高度保守性，自身不翻译蛋白质[7-8]，但在生物体内可以通过多种代谢途径发挥调控作用。研究发现，多种miRNA 在子宫内膜癌的发展过程中发挥着重要作用，例如miR-1202 降低或miR-196a 升高影响AN3CA 和HEC-1-A 细胞增加子宫内膜癌细胞迁移和侵袭能力[9]；miR-21、miR-205 通过下调PTEN、程序性凋亡基因4 等基因表达水平，促进子宫内膜癌的细胞增殖[10]；miR-106b-93-25 调节p21 和BIM，减少子宫内膜癌细胞周期停滞及细胞凋亡[11]。然而，目前miRNA 在AEH 中的研究较少。近期有报道显示，miR-205、miR-146a、miR-1260b 可作为分子标志物来鉴定AEH 和典型子宫内膜增生[12]，因此miRNA 可能在不同子宫内膜状态转化间发挥作用。

本实验采用测序速度快、准确度高的高通量测序技术检测AEH 与正常子宫内膜组织miRNA 的差异性。研究中分别提取3 例正常子宫内膜组织及3 例AEH 组织的总RNA 并进行文库构建，分析各样品中的miRNA 及靶基因情况。通过分析共筛选出18 种具有明显差异的miRNA，其中上调17 个，下调1 个。为进一步明确其在机体内的功能，对筛选出的具有显著差异的miRNA 进行靶基因功能富集和通路分析比较，结果发现差异性miRNA 的靶基因大部分富集在肿瘤或者机体代谢的信号传导相关通路上，意味着这些具有差异的miRNA 可能通过激活肿瘤及机体代谢途径对靶基因发挥作用。这与目前已知的AEH 发生机制相符，说明AEH 不单是一种肿瘤相关的病变，机体代谢性异常可能也参与AEH 疾病的发展。

通过构建差异miRNA 之间的作用网，分析差异miRNA 共同调控的靶基因，作用网显示miR-577、miR-182-5p、miR-4286 相互之间有着密切关系。且这三种miRNA 已经被证实分别在多种肿瘤及机体代谢疾病中发挥重要的作用。miRNA-182-5p 在前列腺癌[13]、胃癌[14]，miR-4286 在非小细胞肺癌[15]、食管癌[16]，miR-577 在胃癌[17]等肿瘤中均有表达。靶向调控相应靶基因，激活并促进肿瘤细胞的侵袭和增殖能力。通过对miR-577、miR-182-5p、miR-4286 进行靶基因预测，结果发现其均可通过调节Smad 发挥作用。而Smad 被认为是子宫内膜癌的相关靶点[18]，且有研究发现，miRNA-182-5p 在膀胱癌组织中可以靶向作用于Smad 4 发挥致癌作用[19]。但是到目前为止，尚未有研究这三种miRNA 在AEH 中的调节机制，由此提示需要进行后期验证，进一步确定miR-577、miR-182-5p、miR-4286 与Smad 4 之间是否存在调节关系。

差异miRNA 的靶基因功能富集和通路分析发现，miR-577、miR-4286 的靶基因均与AMPK 信号通路相关。AMPK 信号通路是体内中枢代谢转换的重要途径，且AMPK 已被确认是糖尿病患者的治疗靶点[20]。在AEH 中，miR-577、miR-4286 是否通过AMPK 信号通路发挥作用，还有待进一步研究。另外，成纤维细胞生长因子21（FGF-21）水平的降低可能与糖尿病发生具有相关性，此前Chen 等[21]发现miR-577 可通过负向调节FGF-21 影响机体内的血糖及血脂水平。由此可见，miR-577、miR-4286 可能通过机体的代谢途径参与AEH 的发生。

综上所述，本研究通过高通量测序技术检测到AEH 和正常子宫内膜组织中差异的miRNA，通过对差异miRNA 进行生物学分析，了解差异miRNA 在AEH 中可能发挥的作用和机制。然而，由于本试验中检测样本数量较少，使得试验存在一定的局限性，还有待于在大量的组织样本中进行进一步的验证，以便更好地了解miRNA 在AEH 中的作用机制。