人参皂苷Rb1 调控内质网应激对脓毒症小鼠重要脏器的保护作用

黄 敏 陶星宇 贾宝辉 杨少龙 徐春凤

1.南昌大学第三附属医院老年医学科，江西南昌 330000；2.南昌大学第四附属医院重症医学科，江西南昌 330003；3.河南省天然药物提取和医疗技术应用工程中心，河南郑州 451460；4.郑州市重症感染、创伤与修复重点实验室，河南郑州 450007；5.郑州铁路职业技术学院病理教研室，河南郑州 450052

脓毒症（Sepsis）是指感染引起的宿主反应失调，可产生危及生命的器官功能损害。目前其临床机制还不十分清楚，临床上多认为是由细菌感染激发的内源性炎症介质的相互作用进而造成全身各系统、器官的损伤[1]。心脏和肺作为机体重要的器官，在脓毒症受累的脏器中比较常见。近些年已有相关研究认为内质网应激在脓毒症造成的重要器官损伤的发生中具有重要作用[2]。姚咏明等[3]提出在脓毒症的发病过程中，各种刺激均可影响细胞内质网的功能状态，而内质网应激本身能参与机体各器官功能的损伤，其反应状态对调控脓毒症病理进程具有重要影响。脓毒症可以引起内质网应激，而内质网的激活又参与脓毒症组织器官的坏死[4]。伴侣蛋白葡萄糖调节蛋白78（GRP78）是内质网应激的标记性蛋白，而凋亡蛋白caspase-12 通路是内质网特有的细胞凋亡信号转导通路，两者都能作为具有特异性的内质网应激损伤的相关蛋白。

本研究通过检测脓毒症小鼠重要器官GRP78 及caspase-12 的表达，观察人参皂苷对脓毒症小鼠是否具有保护作用以及探讨其可能的保护机制是否通过抑制内质网应激的过表达来实现。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康雌性小鼠60 只（4～6 周龄C57BL/6，饲养条件为：温度18～22℃，湿度50%～60%。购于三峡大学，许可证号：SYXK（鄂）2017-0012），体重25～30g。所有实验动物对待和照顾严格遵循《实验动物管理条例》[5]，并经过郑州大学实验审批。按照随机数字表法分为正常组、假盲肠结扎并穿孔（CLP）组、人参皂苷组、CLP组，每组15 只。

1.2 主要试剂及仪器

注射用人参皂苷Rb1（50 mg/支，批号：110704-201827，上海源叶生物科技有限公司），30%丙烯酰胺（批号：680853295，北京索莱宝生物科技有限公司），小鼠单抗β-actin（批号：ah01032107，武汉博士德生物工程有限公司），兔多抗grp78（70～78 kD）（批号：00019435，武汉三鹰生物技术有限公司），兔多抗caspase-12（45 kD）（批号：gr143401-9，Abcam）；电子天平（精度0.01 mg，北京赛多利斯仪器系统有限公司），水平摇床（TS-1，江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司），电泳仪（北京六一仪器厂），电泳槽（北京六一仪器厂），病理切片机（德国Leica RM 2016 轮转式切片机），奥林巴斯BX53 型生物显微镜，载玻片及盖玻片（江苏世泰实验器材有限公司）。

1.3 小鼠脓毒症模型制备

建立脓毒症小鼠模型[6]。动物术前禁食12 h，腹腔注射质量分数为7%的水合氯醛350 mg/kg 麻醉，于左下腹作长1～1.5 cm 切口，游离肠系膜和盲肠，在距盲肠盲端2/3 长度处环行结扎，在距盲端1 cm 处贯通穿刺，挤出粪便少许，回纳肠系膜和盲肠入腹腔。逐层缝合关腹，其中假CLP 组只进行开腹关腹处理，术后不注射人参皂苷，正常组不做任何处理。模型制备成功后立即向小鼠人参皂苷组腹腔注射20 mg/kg 的人参皂苷Rb1 溶液，而CLP 组和假CLP 组则注射等体积的生理盐水，之后每间隔8 h 追加腹腔注入。术后小鼠自由进食饮水，24 h 后取材。

1.4 一般状况和大体形态学

动物造模术后24 h 内观察动物有无萎靡、寒颤、竖毛、腹泻、脓性尿及眼角分泌物增加，以及其呼吸、大小便、饮食和活动情况。

1.5 病理学检测

动物造模术后24 h 处死动物，将取得的小鼠心肌及肺组织浸入10%甲醛溶液中固定，经乙醇脱水，石蜡包埋，切片，苏木精-伊红（HE）染色，光镜下观察，分析各组病理改变。

1.6 蛋白测定

将每组取得的6 只小鼠的心肌及肺组织保存。Western blot 检测GRP78、caspase-12 蛋白表达：组织块置于EP 管中匀浆及裂解，将裂解液移至离心管中，4℃下12 000 r/min 离心5 min（离心半径7.5 cm），取上清液-20℃保存。用磷酸缓冲盐溶液（PBS）适当稀释蛋白，避光孵育30 min 后电泳，转膜。用含5%脱脂奶粉的封闭液（TBST）浸泡PVDF 膜，摇床封闭2 h，再将PVDF 膜浸泡于一抗孵育液中，4℃孵育过夜，TBST充分洗涤PVDF 膜。稀释二抗，使PVDF 膜浸泡于二抗孵育液中，摇床孵育2 h。将ECL 试剂中增强液与稳定的过氧化物酶溶液按1∶1 比例混匀，滴加工作液于PVDF 膜上，荧光带明显后吸去多余底物液，覆上保鲜膜，X 光胶片压片后依次放入显影液显影、定影液定影，冲洗晾干，扫描胶片。

1.7 统计学方法

采用SPSS 18.0 统计学软件对所得数据进行分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般状况及大体观

与正常组比较，CLP 组小鼠活动减少，嗜睡，精神明显萎靡，食欲减退，体重减轻，脓尿。濒死前寒颤、呼吸窘迫。解剖可见CLP 组小鼠腹腔混浊，脓性渗出液较多，伴恶臭；盲肠肿胀发黑、坏疽和粘连；心脏等重要脏器颜色暗红，表面可见出血斑点。人参皂苷组小鼠上述改变均较CLP 组明显减轻，解剖人参皂苷组小鼠腹腔未见明显脓性渗出，无恶臭，盲肠轻度肿胀，无粘连，心脏等重要脏器颜色表面未见明显出血斑点。与CLP 组比较，假CLP 组小鼠各方面情况与人参皂苷组大致相同或更轻。

2.2 病理学改变

肺组织：CLP 组可见肺间质及肺泡毛细血管明显扩张，充血水肿，肺泡间隔增宽，部分区域肺萎缩，肺泡腔大量炎症细胞浸润；人参皂苷组肺泡组织结构相对清晰、完整，炎症细胞浸润减轻，肺泡大小均匀；正常组及假CLP 组病理下组织清晰可见，未见明显异常。

心肌组织：CLP 组心肌横纹模糊，波浪样变、细胞核坏死嗜酸性变，炎症细胞浸润；人参皂苷组炎症细胞浸润较少，心肌横纹可见，坏死细胞少；假CLP 组和正常组心肌纤维均排列整齐，未见异常。见图1。

2.3 内质网应激因子蛋白表达

图1 4 组小鼠肺组织、心肌组织病理下改变（HE 染色，200×）

与假CLP 组比较，CLP 组心肌及肺组织GRP78、caspase-12 蛋白表达水平在术后均显著上调，差异均有高度统计学意义（均P＜0.01）。与CLP 组比较，人参皂苷组心肌及肺组织GRP78、caspase-12 蛋白表达水平均显著减少，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与假CLP 组比较，人参皂苷组蛋白表达水平略高，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2、表1。

图2 人参皂苷Rb1 对心肌、肺组织内质网应激因子GRP78、caspase-12 蛋白表达

表1 心肌、肺组织内质网应激因子的测定（）

表1 心肌、肺组织内质网应激因子的测定（）

注：与假CLP 组比较，*P＜0.01；与CLP 组比较，#P＜0.05。GRP78：葡萄糖调节蛋白78

3 讨论

本实验结果表明，给予人参皂苷Rb1 能够减轻脓毒症小鼠心肌和肺组织内质网应激因子GRP78 及caspase-12 蛋白表达，减轻脓毒症小鼠的感染程度及重要器官损伤。

内质网应激是由于未折叠或错误折叠的蛋白质累积导致内质网结构和功能的失衡。持久或者强烈的内质网应激则会引发程序性细胞死亡或凋亡[7]。内质网应激是脓毒症的重要病理机制，有助于成为病情诊断及治疗的合适靶点[8]。Ferlito 等[9]发现内质网应激在脓毒症发病过程起主要的负面作用，并提出临床干预的新靶标以及治疗的潜在策略。GRP78 是启动内质网应激和内质网稳态调节的关键因子之一[10-11]。下调GRP78 能够明显减轻内质网的氧化应激，改善脓毒症细胞损伤[12]。caspase-12 是内质网上特有的一种caspase 蛋白，只在内质网应激引起的细胞凋亡中出现，并在内质网应激介导的小鼠凋亡途径中发挥核心作用[13]。本研究观察到，CLP 组小鼠心肌及肺组织中检测到的GRP78 和caspase-12 蛋白浓度均能较假CLP 组及正常组明显升高。

脓毒症被定义为感染伴器官功能障碍，寻找改善和治疗脓毒症的药物仍是当前的任务所在[14]。中医认为，脓毒症属于外感病症中危重症候，“瘀血、热毒”是脓毒症的主要发病机制，治疗以“清热凉血，解毒，活血行瘀通络”为原则，在西医常规治疗的基础上加用中药治疗可有效抑制炎症介质的产生和释放，抑制脓毒症患者过度免疫应答[15]。人参皂苷是人参的主要成分，其药用价值已得到广泛肯定，已应用于多种疾病的治疗和预防[16-17]。人参皂苷Rb1 作为人参提取得到的一种活性物质，具有多种药理活性，提取及分离也相对简单，是目前的研究热点[18]。

研究指出，人参皂苷可以减轻炎性反应及氧化应激，增加一氧化氮合成，从而减轻内皮细胞的损伤[19]。曹畅等[20]指出人参皂苷Rb1 可以通过抗氧化、抗凋亡、抑制钙超载等机制在缺血再灌注损伤中发挥保护作用，能减少炎性因子的释放，抑制白细胞趋化及黏附，降低血管内皮损伤，促进血管新生等。冯其麟等[21]在实验中发现给重症感染小鼠尽早注射人参皂苷Rb1 可以降低小鼠体内的炎性反应水平，其机制可能是通过降低内质网内异常蛋白表达，缓解细胞凋亡启动进程而实现。臧安缘等[22]在构建大鼠心肌缺血模型实验中证实人参皂苷Rb1 可改善心肌缺血大鼠细胞损伤，通过减少线粒体释放凋亡因子，清除氧自由基，抑制心肌细胞的凋亡及自噬通路的传导，从而抗心肌缺血保护心肌。Zhao 等[23]在发现人参皂苷Rb1作为人参的生物活性成分，能够诱导下调Bax/Bcl-2比值和caspase-3表达水平来预防大鼠脊髓缺血再灌注损伤。

4 小结

总之，人参皂苷Rb1 因其相对简单的提取过程，并且在人参、三七、西洋参等植物中占有较大比例等优势，近年来越来越受到重视。人参皂苷Rb1 能够对脓毒症小鼠起到一定的保护作用，可通过抑制内质网应激的过度表达而发挥作用，但脓毒症发病复杂，机制尚未完全阐明，并且人参皂苷Rb1 是否存在其他途径减轻炎性反应还有待证实，关于人参皂苷Rb1 对脓毒症的具体保护机制还需进一步研究。