柱前衍生-高效液相色谱法检测测定沉香叶中γ-氨基丁酸的含量

张 健，陆颖珊，温嘉倩，郑秀榕，闫 冲 （广东医科大学，广东东莞 523808）

γ-氨基丁酸(Gamma-aminobutyric acid , GABA)是一种重要的中枢神经系统抑制性神经递质，在谷氨酸脱羧酶(GAD)的作用下由谷氨酸脱羧生成，与突触后膜的GABA受体结合而发挥作用。随着研究技术的发展，越来越多的证据表明GABA系统异常与常见重性精神疾病如精神分裂症、双相障碍、重性抑郁障碍等密切相关[1]。另外，GABA拥有良好的水溶性和热稳定性，以及食用安全性，并可用于饮料等食品的生产[2]。沉香叶为瑞香科植物白木香Aquilaria sinensis(Lour.) Spreng的叶子。《中国药典》(2015版)中记载：沉香行气止痛，温中止呕，纳气平喘，用于胸腹胀闷疼痛，胃寒呕吐呃逆，肾虛气逆喘急。相对于沉香而言，沉香叶的各种研究还处于起步阶段，很多学者已经意识到曾经被当做废料处理的沉香叶，其中所含的有效成分也有很大的开发利用价值[3]。有文献报道沉香叶的乙醇提物具有镇痛、抗炎、促进小肠运动、泻下、止血、抗脑缺血缺氧、降血糖、抗肿瘤等活性[4]。沉香叶中黄酮类化合物有抗氧化活性[5]，但未见有文献报道沉香叶含有GABA。因此，为进一步提高沉香树的综合利用价值，本实验建立了沉香叶中GABA含量的HPLC测定方法。

1 仪器和试剂

1.1 仪器

Agilent 1100高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)，超纯水设备(北京中科齐力科技公司)，JJ224 BC电子天平(常熟市双杰测试仪器厂)，HH-1数显恒温水浴锅(常州澳华仪器有限公司)，TGL-16 G高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)，PB-10标准型pH计(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)。

1.2 试剂

GABA对照品购自上海源叶生物科技有限公司(LOT Z08A8H33553)；2, 4-二硝基氟苯购自上海麦克林生化科技有限公司。乙腈(acetonitrile)为色谱纯；甲醇(CH3OH)、氢氧化钠(NaOH)、碳酸氢钠(NaHCO3)、磷酸二氢钠(NaH2PO4)均为分析纯。

1.3 材料

沉香叶摘于广东医科大学(东莞校区)药用植物园，原植物经广东医科大学闫冲教授鉴定为瑞香科植物白木香Aquilaria sinensis(Lour.) Spreng。

2 方法和结果

2.1 对照品溶液的制备

精确称取GABA对照品适量，用超纯水溶解，制成1 g/L的对照品溶液，精密量取一定质量浓度的GABA标准溶液1 mL于10 mL棕色瓶中，加入0.5 mol/L碳酸氢钠(pH9.0)溶液1 mL，再分别加入1% 2,4-二硝基氟苯 (FDNB)乙腈溶液0.2 mL，置于60 ℃水浴锅中避光加热30 min后取出，冷却，分别添加pH6.8的磷酸盐缓冲液至10 mL，混匀，10 000 r/min离心15 min，经0.22 μm微孔过滤，作为对照品溶液[6]。

2.2 样品溶液的制备

从不同沉香树中随机摘取沉香叶，混合后60 ℃烘干，打粉，过40目筛。称取干燥沉香叶粉末5.00 g于锥形瓶中，加超纯水约90 mL，95 ℃水浴加热40 min，放冷后过滤，滤渣再用水洗涤后，合并滤液，定容至100 mL。

量取1 mL上述溶液置于10 mL棕色容量瓶中，加入0.5 mol/L碳酸氢钠(pH9.0)溶液1 mL，再分别加入1% FDNB(2, 4-二硝基氟苯)乙腈溶液0.2 mL，置于60 ℃水浴锅中避光加热30 min后取出，冷却至室温，添加pH6.8磷酸盐缓冲液至10 mL，混匀。取适量溶液至离心管中，10 000 r/min离心15 min，经0.22 μm微孔过滤，作为样品溶液。

2.3 色谱条件

色谱柱：Kromasil C18 色谱柱(150 mm × 4.6 mm，5 μm)；流动相A：V(乙腈)：V(超纯水)=1:1，流动相B：pH=6.8的含有3%四氢呋喃的磷酸盐缓冲液，A:B=35:65；检测波长：360 nm；柱温：27 ℃；流速：1.000 mL/min；进样量：5 μL。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 取浓度为0.01、0.02、0.06、0.08、0.1 g/L的GABA标准溶液，参照“2.1”方法进行衍生化反应，按照“2.2”色谱条件进样检测，以其峰面积为纵坐标(y, Au)，质量浓度为横坐标(x,g/L)，绘制标准曲线。线性回归方程为y=286.1x+3.57，r= 0.9994。

2.4.2 精密度试验 取质量浓度为0.04 g/L的GABA对照品溶液，按“2.2”方法操作后，在“2.1”色谱条件下重复进样6次，其峰面积RSD为0.89 %，表明仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性试验 取同一批沉香叶样品溶液，分别于配置2、4、8、12 h后按照2.2色谱条件进样检测GABA含量。GABA衍生物峰面积RSD为1.20 %，说明检测物在12 h内稳定。

2.4.4 重复性试验 取同批沉香叶样品溶液，按样品处理方法制备沉香叶样品溶液5份，分别测定样品溶液中GABA的含量，结果其峰面积RSD为2.50%，说明该实验重复性良好。

2.4.5 加样回收率试验 精密称取5.00 g已知含量的沉香叶粉末9份，按表1分别加入GABA对照品溶液，按照样品方法处理后，测定GABA含量，结果见表1。

2.5 样品定性分析及含量测定

2.5.1 样品定性分析 通过试验多种流动相的比例，GABA对照品与样品保留时间均一致，且二者的紫外吸收光谱特征也一致(扫描波长为200～400 nm)。对照品和样品色谱图见图1。

2.5.2 样品定量分析 取3批沉香叶粉末样品及对照品溶液，外标法测定GABA含量，分别为0.3028、0.2815和0.3105 mg/g，平均0.2983 mg/g。

3 讨论

本实验首次建立了沉香叶中GABA含量的HPLC测定方法，重复性好，简便快捷，为进一步的开发研究沉香叶的功能提供了基础和依据。实验结果表明沉香叶中含有一定量的GABA，3批沉香叶中GABA含量分别为0.3028、0.2815和0.3105 mg/g，说明沉香叶中含有的GABA具有很大的开发利用价值。

表1 方法的回收率实验结果 (n=3)

图1 GABA对照品(A)和沉香叶样品(B)的高效液相色谱图

除此之外，本实验还探索了流动相pH为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0时各组峰的峰形及分离度，最终发现流动相pH为6.8时，GABA和其结构近似峰达到最好的分离度。在流动相pH为6.8时，流动相A和B的比例为35:65时，GABA保留时间控制在14 min以内，此时各组峰的峰形良好且能达到基线分离。