应用正交实验优化扁藻胞外多糖硒化工艺的研究

刘梓茂 ，温俊昊，潘荣华，魏文滨，黄永梅，罗 辉，吴斌华* （1.广东医科大学海洋医药研究院南海海洋生物医药资源研发公共服务平台，广东湛江 5403；.广东医科大学第一临床医学院，广东湛江 5403；3.广东医科大学海洋药用生物资源协同创新中心，广东湛江 5403；4.广东天然药物研究与开发重点实验室，广东湛江 5403）

扁藻是一种重要的海洋微生物，人工培养的纯净高密度藻液包含着大量的胞外多糖[1]。研究发现，多糖类物质存在生物活性，拥有调节免疫细胞活性，抑制癌细胞生长等功能[2]。但天然多糖生物活性普遍较低，无法满足药用要求，且难溶于水，不易对其进行深入的药理研究及其临床制剂应用研究。因此需要对其进行化学结构修饰，其中将其硒化是一个较好的研究方向。硒是人体内必须的微量元素，发挥着抗氧化、保护细胞膜、提高机体免疫力、抵抗癌细胞以及消除重金属积累等作用[3-5]。硒元素与扁藻胞外多糖以共价键方式相结合，可将无机硒元素转化为有机硒。相较于无机硒，有机硒在人体内毒性更低，吸收率更高，可以被人体更好地吸收利用[6]。而经过硒化修饰的多糖可以更好地提高生物活性，如抗癌活性、免疫调节能力等。因影响硒化扁藻胞外多糖的产率和多糖硒含量的因素较复杂，本实验通过制取纯净扁藻胞外多糖，并且以正交实验对多糖硒化条件进行优化，以期为大规模制备硒化扁藻胞外多糖提供依据。

1 材料和方法

1.1 仪器及试剂

90-1磁力搅拌器(上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司)；RE-5210A旋转蒸发仪(上海荣生生化仪器厂)；JXN-300冷冻离心机(美国Beckman公司)；FD-1A-50冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)；KQ-100VDB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Epoch酶标仪(BioTek Instrument)；IRTracer-100傅立叶红外吸收光度计(日本岛津公司)；NexION 300X电感耦合等离子体质谱仪(美国Perkin Elmer公司)；500 Da透析袋(美国YTKH公司)等。

f/2培养基原液的制备参照Harrison等[7]的研究；Sevage溶液的制备参照刘佳维等[8]的研究。无水乙醇(AR，广东光华科技股份有限公司)；亚硒酸钠(Na2SeO3，纯度为99%，上海新宝精细化工厂)；硝酸(广东光华科技股份有限公司)和氯化钡(广东光华科技股份有限公司)；其他试剂均为市售分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 扁藻培养 本实验扁藻来源于本实验室保存的藻种[9]，采集于湛江硇洲岛和徐闻珊瑚礁自然保护区潮间带。大规模扁藻培养条件：f/2海水培养基；25、20 L无菌培养体系；以1 L/min的速度通入，经0.22 μm滤膜过滤空气；每日光照16 h，黑暗处理8 h，磁力搅拌器以60 r/min模拟自然海浪环境。培养约30 d，即可进行扁藻胞外多糖提取。

1.2.2 提取扁藻胞外多糖 操作过程参考文献[10]，并根据实验情况进行改进。(1)藻液浓缩：扁藻藻液使用旋转蒸发器，在45 ℃温和条件下进行蒸发浓缩，大约浓缩到原体积1/10后停止。(2)藻体藻液分离：浓缩藻液在4 ℃、10 000 r/min条件下进行冷冻离心，分离胞外多糖溶液和藻体。随后，在胞外多糖溶液中加入4倍体积无水乙醇进行醇析多糖，取得胞外多糖悬浊液。(3)多糖杂质去除：扁藻胞外多糖悬浊液在4 ℃、10 000 r/min条件下进行冷冻离心10 min，得到粗多糖沉淀后使用超纯水进行复溶，去除不溶杂质。粗多糖水溶液使用截留分子量为500 Da的透析袋透析48 h去除氯化钠，然后在多糖沉淀中加入1/3体积的Sevage溶液搅拌去蛋白后，分离去除Sevage溶液。(4)精多糖提取：使用4倍体积无水乙醇进行醇析，冷冻干燥多糖沉淀得到扁藻胞外多糖。

1.2.3 扁藻胞外多糖硒化反应正交实验 我们选取了反应时间、硝酸质量分数、多糖/ 亚硒酸钠和超声功率等条件，采用正交实验进行硒化设计[11-16]。具体为：(1)称取1.0 g扁藻胞外多糖，加入100 mL硝酸溶液溶解，随后加入1.0 g氯化钡和对应质量亚硒酸钠，充分搅拌溶解。(2)在温度为60 ℃，对应超声功率条件下进行反应，反应时间分别为6、8、10 h。(3)将反应完成体系用饱和NaHCO3溶液调节pH = 7，而后装入截留分子量为1 000 Da透析袋中，透析 24 h 以上，直到透析袋外的水不再显红色为止，得到的溶液冷冻干燥，合成硒化扁藻胞外多糖。称量，计算产率。硒化多糖产率=(硒化扁藻胞外多糖/扁藻胞外多糖)×100 %。配制成0.01%的多糖水溶液，使用电感耦合等离子体质谱仪定量测量硒元素质量，并计算硒化多糖硒元素含量。硒化多糖硒含量=(水溶液硒元素浓度×溶液体积)/(硒化多糖浓度×溶液体积)。

1.2.4 紫外吸光度检测 采用Epoch酶标仪对扁藻胞外多糖和硒化扁藻胞外多糖进行220～800 nm紫外吸光度分析。

1.2.5 红外吸光度检测 采用傅立叶变换红外光谱仪对扁藻胞外多糖和硒化多糖进行红外吸光度扫描检测。

1.3 统计学处理

采用SPSS 20.0软件分析正交实验结果。通过均方寻找各水平因素对多糖产率及多糖硒含量的影响，均方较大的因素为对该因变量影响较大的因素。通过权重系数法对硒化合成工艺进行优化处理。采用综合评分法分别将多糖产率和多糖硒含量最高的积分设定为9分，以此为基数依次对9个实验结果进行评分。将产率的权重系数设定为0.4，硒含量设定为0.6进行加权评分。Y=0.4 Y1+0.6 Y2(Y1为产率由高到低排序，Y2为硒含量由高到低排序)。

2 结果

2.1 扁藻胞外多糖提取率

扁藻大规模培养结束后，将扁藻藻液以低温蒸馏以除去多余水分，在此过程中扁藻为抵御不良环境产生应激反应，分泌大量胞外多糖，平均产率为1.8 g/L。

2.2 以正交实验优化扁藻胞外多糖硒化条件

2.2.1 正交实验结果 选择反应时间、硝酸质量分数、多糖/亚硒酸钠、超声功率，按 L9(34)正交表进行设计。实验结果见表1。

表1 正交实验设计及结果

2.2.2 影响因素的方差分析 影响多糖产率和多糖含硒量的主要因素是超声功率和反应时间，硝酸质量分数和亚硒酸钠含量为次要条件。详见表2。

表2 方差分析表

2.2.3 根据权重评分确定最佳工艺 第4组权重评分最高。最佳反应条件如下：反应时间为8 h，硝酸质量分数为3%，多糖和亚硒酸钠的质量比为1 : 1.2，超声功率为70 W。

2.3 紫外吸光度检测结果

紫外吸光度显示在280 nm处无吸收峰，样品中无蛋白质物质，详见图1和图2。

图1 扁藻胞外多糖紫外吸收扫描

图2 硒化扁藻胞外多糖紫外吸收扫描

2.4 红外吸光度检测结果

从图3可以看出，在3 421.72、1 624.06、1 141.86和1 011.03 cm-1处均存在吸收峰，分别为-OH、C=O、C-O和C-O-C特征吸收峰。图4中可见3 421.72、1 114.86、1 076.28和983.70 cm-1处均有吸收峰，分别为-OH、C-O、Se=O和Se-O特征吸收峰，在743 cm-1和453 cm-1处无亚硒酸钠的特征吸收峰。

图3 扁藻胞外多糖红外吸收光谱

图4 硒化扁藻胞外多糖红外扫描结果

3 讨论

本次研究提供了一种生产、提取扁藻胞外多糖，并将其硒化的优化方案。该方案能够在无菌状态下大量培养扁藻，提纯扁藻胞外多糖，多糖提取率比相关文献高[17]，平均产率高达1.8 g/L，考虑是由于在提取过程中运用了低温蒸馏浓缩扁藻藻液，引起了扁藻的应激反应，从而诱导扁藻产生了大量的胞外多糖。

通过对扁藻胞外多糖的紫外吸光度进行检测，我们并没有在280 nm处检测到吸收峰，此处为含苯环蛋白质的特征吸收峰，证明本实验成功去除了蛋白杂质。红外吸光度扫描显示多糖存在-OH、C=O、C-O、C-O-C 的吸收峰，其中C=O证明含有醛基，C-O-C是吡喃型糖的特征吸收峰，因此可以证明该多糖为吡喃型多糖。

多糖硒化修饰步骤中，影响硒化结果的因素较多，如亚硒酸钠与多糖的质量比、催化剂质量、温度、硝酸质量分数、超声频率、反应时间等。参考相关文献[11-16]，我们选取4个影响程度较大的因素(硝酸质量分数、超声频率、反应时间和亚硒酸钠与多糖质量比)进行正交设计，通过综合评分法选取最佳硒化反应条件。因多糖硒含量直接与其生物活性的高低有直接关系，故其权重应高于多糖产率，参考林雪燕等[14]的研究，将产率的权重系数设定为0.4，硒含量设定为0.6，进行加权评分，突出硒含量在工艺评定中的重要性，以此得到的最佳制备工艺：反应时间为8 h，硝酸质量分数为3%，多糖和亚硒酸钠的质量比为1 : 1.2，超声功率为70 W。影响硒化多糖产率和产物中硒含量的因素由大到小依次为：超声功率、反应时间、亚硒酸钠含量、硝酸质量分数。与其他硒化多糖实验比较[15-16]，本实验硒化多糖产率和硒化率均有所提高，特别是在最佳制备条件下差别最为明显，可能是因为本实验中引进了超声，有利于促进硒元素和多糖的结合，使硒化率明显提高。

将硒化扁藻胞外多糖再次进行红外吸光度扫描，我们发现上述的吡喃型多糖特征吸收峰仍然存在，证明其结构依然保留。其中-OH 特征吸收峰有所下降，可能是其被硒化基团替代所致，而C=O特征吸收峰较未硒化多糖弱，可能是由于硒化基团取代了羰基或者硝酸破坏了其固有的结构。Se=O和Se-O为新出现的特征吸收峰，由于样品经过透析除去原料中的亚硒酸钠，此处出现的硒化基团特征吸收峰排除了原料的影响，表明多糖化学修饰成功完成，硒元素是通过共价键的方式与硒化多糖连接的。

本次研究主要探索了硒化扁藻多糖的最佳硒化工艺，同时对其结构进行了初步分析，所获得的扁藻胞外多糖以及硒化扁藻胞外多糖可应用于随后的功能研究。