谷子SiBAK1在油菜素内酯信号通路及细胞死亡信号调控通路中的功能

武国凡，梁少珍，吴旺泽，张丽娜，郑晟

(西北师范大学生命科学学院，甘肃 兰州 730030)

谷子是一种禾本科C4农作物，具有较高的营养价值、水分利用率高、耐贫瘠和耐旱等特性；谷子还具有生长周期短、二倍体基因组较小和易栽培等优点而被作为遗传学研究的模式植物[1-2].

植物体细胞胚胎发生受体样激酶(somatic embryogenesis receptor-like kinase，SERKs)属于植物类受体蛋白激酶(receptor-like protein kinases，RLKs)中亮氨酸富集型受体蛋白激酶(LRR-RLKs)亚家族的成员，广泛参与植物生长发育以及先天免疫[3-4].研究发现，SERKs作为共受体通过与不同的受体结合从多方面调节植物的生长发育，如植物根的发育[5]、雄配子体发育[6-7]以及气孔的发育和建成[8-9].早期通过正向遗传学实验筛选到1个对体外施加BR不敏感的突变体—brassinosteroid insensitive1 (bri1)，该突变体具有叶片卷曲肥厚、植株矮化且雄性不育等性状[10-11].2002年，Li等[12]通过激活标签法筛选得到brassinosteroid insensitive1 (BRI1)弱突变体bri1-5的抑制子—Associated receptor kinase1bak1 (BAK1)，证明BAK1与BRI1相互作用.同年，这一重大发现被Nam等[13]通过酵母双杂交方法得以证明.在拟南芥(Arabidopsisthaliana)中共有5个SERKs参与BR信号通路，为SERK1～SERK5[14-16]，BAK1又称SERK3，BKK1又名SERK4.2007年，He等[14]和Chinchilla等[17]同时发现BAK1除了参与BR信号通路以外还调控了另一条不依赖于BR信号通路的细胞死亡途径，BAK1缺失突变体在用多种Pathogen-associated molecular patterns(PAMPs)处理后会表现出明显的防卫反应减弱表型.例如幼苗生长、氧化物爆发以及Mitogen-activated protein kinase(MAPK)激活方面均会受到抑制[18-20].当BAK1和BKK1同时敲除后细胞死亡现象比单独敲除BKK1更加严重，并伴随防御基因表达量升高[14]，说明SERKs家族基因存在部分功能冗余.

本研究在BR受体突变体bri1-5以及细胞死亡突变体bak1-3/bkk1-1背景下，过表达SiBAK1，探究谷子BAK1即SiBAK1是否参与到油菜素内酯信号通路和细胞死亡信号通路中.

1 材料与方法

1.1 材料

本试验所用材料为拟南芥(Arabidopsisthaliana) Col、WS2生态型、拟南芥BR受体突变体bri1-5、拟南芥细胞死亡双突变体bak1-3/bkk1-1、本氏烟草(Nicotianabenthamiana) (均由兰州大学黎家实验室提供)和豫谷.植物材料培养条件：1/2MS固体培养基(22 ℃，16 h光照/8 h黑暗交替培养)、土壤培养条件：Col、WS2和bri1-5，22 ℃，16 h光照/8小时黑暗交替培养；bak1-3/bkk1-1突变体土壤培养条件为：28 ℃，16 h光照/8 h黑暗交替培养.

1.2 Gateway技术克隆SiBAK1

根据NCBI数据库中SiBAK1序列，设计Gateway接头引物(表1)，以豫谷为材料提取RNA并反转录得到cDNA.以豫谷的cDNA为模板，通过PCR得到SiBAK1片段后，经BP反应体外重组转入入门载体，热激转入大肠杆菌(DH5α)，获取阳性克隆送北京华大基因公司测序，序列比对正确后进行LR反应体外重组转入表达载体中，最后将其通过热激法转入农杆菌(GV3101)中，-80 ℃保存.

1.3 浸花法转化拟南芥植株

选择4周左右生长健康、长势旺盛、部分花苞绽放的植株，将花浸泡在含有目的基因的根癌农杆菌浸染液中30 s，黑暗处理过夜，置于光下16 h光照/8 h黑暗、22 ℃继续培养.

表1 引物序列

1.4 烟草瞬时转染

取含有目的基因的根癌农杆菌10 μL，接种到3 mL LB培养基中，28 ℃摇床培养至菌的对数生长期；离心并收集菌体，将其重悬于悬浮溶液中(加入10 mmol/L MES (pH5.7)，10 mmol/L MgCl2，200 μmol/L乙酰丁香酮的MS溶液)；调节细胞悬液D600为0.5；静置3 h后用注射器将菌液注入幼嫩烟草叶片的背面；48 h后在注射孔附近取小片叶片背面向上，置于载玻片上，加入适量ddH2O于激光共聚焦显微镜下观察.

1.5 GUS染色

向2 mL离心管中加入1.5 mL GUS染液(0.5 mol/L Na2EDTA(pH8.0)，50 mmol/L K4Fe(CN6)·3H2O，50 mmol/L K3Fe(CN6)，0.1 g/mL X-Gluc，10% TritonX-100，0.05 mol/L PBS (pH7.0))；将长日照条件下生长14 d的拟南芥幼苗置于GUS染液中，37 ℃避光孵育过夜，用75%乙醇脱色后置于体视显微镜下观察.

1.6 根长和下胚轴长度的测量

将消毒灭菌的种子整齐地点在MS培养基上，春化后转移至16 h光照/8 h黑暗、22 ℃培养7 d.将幼苗用镊子轻轻摆放在透明胶带上并粘在A4纸上；扫描后导出图片，使用ImageJ软件测量根长.

将消毒灭菌的种子整齐地点在MS培养基上，春化后，置于光下6 h后迅速将培养皿放置在纸盒中，外层用锡箔纸包裹，置于培养箱中黑暗培养7 d，将下胚轴用镊子轻轻摆放在透明胶带上并粘在A4纸上；扫描后导出图片，使用ImageJ软件测量其长度.

1.7 台盼蓝染色

向2 mL离心管中加入1 mL 95%乙醇，再加入500 μL台盼蓝染色液(1 mL苯酚、1 mL乳酸、1 mL甘油、1 mL ddH2O和0.002 g台盼蓝)颠倒混匀后，将幼苗置入其中，沸水浴30 s(观察幼苗是否着色，若无，可重复沸水浴2～3次)；倒出染色液，最后加入1.5 mL水合氯醛(水∶水合氯醛=1∶2.5，V/V)脱色液，置于摇床上脱色，期间每天换1次脱色液，直至叶片透明，置于倒置显微镜下观察.

2 结果与分析

2.1 SiBAK1生物信息学分析以及亚细胞定位

对已经报道的单子叶植物牡丹(Paeoniasuffruticosa)、葡萄(Vitisvinifera)、山茶(Camellianitidissima)、大豆(Glycinemax)、拟南芥、番茄(Solanumlycopersicum)、本氏烟草、棉花(Gossypiumhirsutum)和双子叶植物高粱、大麦、玉米、凤梨(Ananascomosus)、谷子中的部分SERKs进行了系统进化树分析和蛋白序列比对。进化树分析可知单子叶植物谷子的SiBAK1与其他单子叶植物(如大麦、高粱和玉米)的SERK3同源关系较近(图1)。蛋白序列比对分析得知，SiBAK1及其他物种单子叶、双子叶植物的SERK3蛋白具有胞外结构域、跨膜结构域、胞内激酶结构域，且胞外结构域具有5个亮氨酸重复序列LRRs；双子叶与单子叶植物的SERK3蛋白相比，在SPP(serine proline proline)结构域中缺少部分保守的氨基酸序列(图2-A)；

图1 SiBAK1与其他植物SERKs蛋白的系统进化树分析Figure 1 Phylogenetic tree analysis of SiBAK1 and other plant SERKs proteins

A：蛋白序列N端；B：蛋白序列C端.A：Protein sequence N-terminal；B：Protein sequence C-terminal.图2 SiBAK1及其它物种的SERKs蛋白序列比对以及结构域划分Figure 2 SERKs protein sequence alignment and domain division of SiBAK1 and other species

SiBAK1及其他单子叶和双子叶植物的SERKs胞内激酶结构域具有保守的RD基序(图2B)。

构建了35S驱动的SiBAK1-YFP的农杆菌菌株，并将其瞬时转化至烟草叶片中，通过激光共聚焦荧光显微镜观察，结果如图3所示.在细胞质膜的位置观察到荧光信号，证明SiBAK1主要定位于细胞质膜上.SiBAK1与其他单子叶和双子叶植物，尤其是与研究较为深入的拟南芥的SERK3蛋白具有相似的结构域和亚细胞定位，这表明SiBAK1可能与拟南芥中的BAK1可能具有相似的功能.

A：YFP荧光信号；B：明场；C：图A和图B叠加(Bar=50 μm).A：YFP fluorescence；B：Bright field；C：Fig A and B superposition (Bar=50 μm).图3 SiBAK1主要定位于细胞质膜上Figure 3 SiBAK1 localized on the plasma membrane

2.2 SiBAK1在根、茎、真叶及子叶的维管束中均有表达

SERKs在拟南芥的各个器官均有表达[21].为了进一步研究谷子中的BAK1与拟南芥中的BAK1表达否具有相似性，克隆得到SiBAK1启动子，并转化得到SiBAK1启动子驱动β-葡萄糖醛酸糖苷酶基因(GUS)的转基因植物，对1/2 MS培养基中光下培养14 d的幼苗置于GUS染色液中染色过夜，观察发现：与Col幼苗GUS染色结果(图4-A～C)相比，SiBAK1在植物的真叶及子叶的维管束(图4-D，G)、初生根以及侧根中(图4-E，F，H，I)均有表达.上述实验结果表明,谷子中的BAK1在表达部位上与拟南芥中的BAK1具有相似性.

2.3 SiBAK1能显著恢复bri1-5油菜素内酯缺陷的表型

拟南芥SERKs作为油菜素内酯的共受体可以部分恢复受体突变体bri1-5的BR缺陷表型[14-15].在bri1-5背景下转化得到含35S::SiBAK1-YFP的转基因植物，观察转基因植物在生长发育过程中与油菜素内酯相关的典型表型；土壤培养21 d，观察幼苗叶片及叶柄表型；土壤培养48 d观察植株生长情况；1/2 MS培养基上光下培养7 d观察及测量根长；1/2 MS培养基上黑暗培养7 d观察及测量下胚轴长度.结果表明SiBAK1与拟南芥SERKs在恢复突变体表型上功能类似，过表达SiBAK1能够部分恢复bri1-5叶片皱缩以及叶柄缩短(图5-A)、植株矮小(图5-B)、根长(图6-A，D)及下胚轴缩短(图6-B，E)的表型.光下培养7 d的WS2平均根长为19.5 mm、bri1-5平均根长12.7 mm、bri1-5背景下过表达SiBAK1的幼苗平均根长为17.52 mm；黑暗培养7 d的WS2平均下胚轴长度为22.26 mm，bri1-5平均下胚轴长度为11 mm；bri1-5背景下过表达SiBAK1的平均下胚轴长度为15.35 mm.

A：Col叶片；B：Col茎；C：Col根；D：pSiBAK1:GUS in Col #2叶片；E：pSiBAK1:GUS in Col #2茎；F：pSiBAK1:GUS in Col #2根；G：pSiBAK1:GUS in Col #13叶片；H：pSiBAK1:GUS in Col #13茎；I：pSiBAK1:GUS in Col #13根 (Bars=200 μm).A：Col leaves；B：Col stems；C：Col roots；D：pSiBAK1:GUS in Col #2 leaves；E：pSiBAK1:GUS in Col #2 stems；F：pSiBAK1:GUS in Col #2 roots；G：pSiBAK1:GUS in Col #13 leaves；H：pSiBAK1:GUS in Col #13 stems；I：pSiBAK1:GUS in Col #13 roots (Bars=200 μm)图4 SiBAK1在植物的根、茎、真叶及子叶的维管束中均有表达Figure 4 SiBAK1 is expressed in the vascular bundles of roots,stems,true leaves and cotyledons of plants

BL浓度梯度处理的WS2幼苗根长分别为：17.935 5、24.064 5、5.966 7、6 mm；BL浓度梯度处理的bri1-5的幼苗根长分别为：13.081 1、16、13.540 5、13.436 4；BL浓度梯度处理的过表达SiBAK1转基因植株的幼苗根长分别为：17.517 2、21.137 9、17.897 4、16.228 6.对比0、1 nmol/L BL处理时WS2幼苗根长增加了14.6%；bri1-5幼苗根长增加了10.0%、过表达SiBAK1的转基因植株幼苗根长增加了9.36%.对比1 、10 nmol/L BL处理时WS2幼苗根长缩短了60.26%、bri1-5幼苗根长缩短了8.33%、过表达SiBAK1的转基因植株幼苗根长缩短了8.30%.对比10 、100 nmol/L BL处理时WS2幼苗根长缩短了0.28%、bri1-5幼苗根长缩短了0.39%、过表达SiBAK1的转基因植株幼苗根长缩短了4.89%.在100 nmol/L BL处理时，bri1-5幼苗根长与10 nmol/L BL处理时的根长没有明显变化，而过表达SiBAK1的转基因植株幼苗根长缩短现象明显，表明过表达SiBAK1能够部分恢复bri1-5对BL的敏感性.同时，通过实时荧光定量PCR检测了过表达SiBAK1的bri1-5中BR合成基因CPD(Constitutivephotomorphogenesisanddwarfism)、DWF4(DWARF4)基因的表达量，如图7所示.CPD在转基因植物中的表达量相对于bri1-5下降了13.32%；DWF4在转基因植物中的表达量相对于bri1-5下降了28.47%.上述结果表明，SiBAK1具有类似于拟南芥中BAK1在BR信号通路中具有功能.

A：土壤中生长21 d幼苗表型(Bar=1 cm)；B：土壤中生长48 d成苗表型(Bar=4 cm).A：21 d seedlings phenotype in soil (Bar=1 cm)；B：48 d seedlings phenotype in soil(Bar=4 cm).图5 SiBAK1能显著恢复bri1-5植株矮小、叶片皱缩叶柄缩短的表型Figure 5 SiBAK1 can significantly restore the shortened phenotype of bri1-5 plants and shortened leaf blade

A：1/2 MS培养基中光下培养7 d的幼苗根长生长表型(Bar=1 cm)；B：1/2 MS培养基中黑暗培养7 d的幼苗下胚轴生长表型(Bar=1 cm)；C：BL浓度梯度处理1/2 MS培养基中光下培养7 d的幼苗根长生长表型(Bar=1 cm) ；D：图(A)30株幼苗根长统计结果，显著性差异分析：不同植株根长与对照组WS2植株根长的分析结果(P<0.01)；E：图(B)30株幼苗下胚轴长度统计结果，显著性差异分析：不同植株下胚轴与对照组WS2植株下胚轴的分析结果(P<0.01)；F：图(C)30株幼苗根长统计结果，显著性差异分析：不同植株与WS2对同一BL浓度处理的分析结果(P<0.01).A：Growth phenotype of root length of seedlings cultured under light for 7 days in 1/2 MS medium (Bar=1 cm)；B：Hypocotyl growth phenotype of seedlings cultured in dark medium for 7 days in 1/2 MS medium (Bar=1 cm)；C：Root growth phenotype of seedlings cultured under light concentration of 1/2 MS medium for 7 days in BL concentration gradient treatment (Bar=1 cm)；D：Fig (a) Root length of 30 seedlings statistical results,significant difference analysis: analysis of root length of different plants and root length of WS2 plants of control group(P<0.01)；E：Fig (b) statistical results of hypocotyl length of 30 seedlings,significant difference analysis：different analysis of hypocotyls of plant hypocotyls and control group WS2 plants(P<0.01)；F：Fig (c) Statistical results of root length of 30 seedlings,significant difference analysis：different plants treated with WS2 for the same BL concentration analysis results (P<0.01).图6 SiBAK1能够部分恢复bri1-5根长缩短、下胚轴缩短的表型，能够部分恢复bri1-5对BL的敏感性Figure 6 SiBAK1 can partially restore bri1-5 phenotype with shortened root length and hypocotyl shortening,which can partially restore the sensitivity of bri1-5 to BL

A：qRT-PCR检测SiBAK1过表达植株#2体内BR合成基因CPD表达量；B：qRT-PCR检测SiBAK1过表达植株#2体内BR合成基因DWF4表达量.A：qRT-PCR detection of SiBAK1 overexpressing plant #2 in vivo BR synthesis gene CPD expression；B：qRT-PCR detection of SiBAK1 overexpressing plant #2 in vivo BR synthesis gene DWF4 expression.图7 WS2、bri1-5、过表达SiBAK1至bri1-5转基因植株中CPD，DWF4基因表达量分析Figure 7 Analysis of CPD and DWF4 genes expression in WS2,bri1-5,overexpressed SiBAK1 in bri1-5 transgenic plants

2.4 SiBAK1能显著抑制bak1-3/bkk1-1突变体细胞死亡的表型

拟南芥中的BAK1参与细胞死亡的调控，谷子的BAK1是否也参与到植物的细胞死亡调控中，通过过表达SiBAK1到细胞死亡突变体bak1-3/bkk1-1中，发现过表达SiBAK1至bak1-3/bkk1-1的转基因幼苗在22 ℃生长条件下生长3周，并未出现早期衰老的症状，过表达SiBAK1的bak1-3/bkk1-1的突变体的细胞死亡表型被显著抑制(图8-A).通过台盼蓝染色实验证明，土壤培养13 d的突变体bak1-3/bkk1-1着色较深，表现出明显的细胞死亡特征，而过表达SiBAK1至bak1-3/bkk1-1的突变体着色程度明显降低，说明细胞死亡被显著抑制(图8-B).上述结果说明，SiBAK1类似拟南芥中的BAK1参与到细胞死亡的信号调控中.

3 讨论与结论

目前，在拟南芥中发现600多个RLKs，其中SERKs作为一类非常重要的LRR-RLKs被多数人研究[3-4].不同物种的SERKs蛋白的序列分析表明，SERKs是存在于单子叶植物、双子叶植物和非维管植物中的高度保守的蛋白质家族.在进化方面，SERKs蛋白分为4支，单子叶SERKs蛋白、2个不同分支的双子叶子SERKs蛋白以及非维管SERKs蛋白.拟南芥中SERKs蛋白分为2支，一支为SERK1和SERK2，另一支为SERK3～SERK5.由于SERKs蛋白的胞内外结构域具有明显的差异，就使得SERKs具有不同的生物学功能[22].SERKs与不同LRR-RLK结合形成受体复合体调控植物的不同生理过程，SERK1～SERK4能够与油菜素内酯受体BRI1形成受体复合体调控BR信号途径[12-15].SERK1和SERK2与雄配子体发育密切相关[6-7].自发现BAK1以来，经研究发现它作为共受体参与植物体内多个信号通路，因其功能的多样性而受到科学家们广泛关注.本研究将谷子的BAK1作为研究对象，探究其功能.根据在NCBI查找的SiBAK1序列，通过进化树分析可知，进化树分析可知，单子叶植物谷子的SiBAK1与其他已报道的禾本科单子叶植物如大麦、高粱、玉米的SERK3同源关系较近；蛋白序列分析可以得出，SiBAK1及其他物种单子叶、双子叶植物的SERK3蛋白都具有1个感知胞外化学信号胞外结构域、1个锚定在细胞质膜上的跨膜结构域、1个将胞外信号传递到胞内的胞内激酶结构域，且胞外结构域具有5个亮氨酸重复序列LRRs；双子叶与单子叶植物的SERK3蛋白相比，在丝氨酸-脯氨酸(SPP)结构域中缺少部分保守的氨基酸序列，而SPP结构域能够保证胞外结构域在接受外源信号时具有结构灵活性，SPP结构域通常被认为是SERKs的重要标志，这也是单子叶和双子叶植物SERKs在进化分支上的一个重要的证据.

A：22 ℃土壤生长幼苗表型(Bar=1 cm)；B：土壤生长13 d的幼苗台盼蓝染色结果(Bars=200 μm).A：Seedlings phenotype of soil growth at 22 ℃(Bar=1 cm)；B：Trypan blue staining results of seedlings grown for 13 days in soil (Bars=200 μm).图8 SiBAK1能显著抑制bak1-3/bkk1-1细胞死亡表型Figure 8 SiBAK1 can significantly restrain bak1-3/bkk1-1 cell death phenotypes

BAK1与BRI1体内具有多个磷酸化位点[23].研究表明，BRI的胞外结构域最先感知到BR信号，并与之结合，BR的稠环部分再与BAK1胞外LRR的N端结合，最终形成BRI1-BL-BAK1结构，BRI1发生自磷酸化，随后引起BAK1胞内激酶区发生磷酸化，磷酸化后的BAK1会进一步磷酸化BRI1，充分激活BRI1的活性，从而将BR信号传递到信号通路的下游[24-25].通过蛋白序列比对SiBAK1与拟南芥BAK1的结构类似，因此推测在谷子体内BR信号传递与拟南芥体内的传递方式类似，谷子的BRI1的胞外结构域与BR结合再与SiBAK1的胞外域结合引起一系列的磷酸化，将信号传递到信号通路的下游.

由于植物不同于动物可以通过主动逃避的方式应对外界的一系列生物或非生物胁迫，在长期进化过程中，植物体内进化出一套非常复杂的先天免疫机制[26]，如BAK1能够与FLS2结合并相互磷酸化引发植物免疫反应.2007年，He等[14]研究结果表明，当同时敲除BAK1和BKK1时，在22 ℃培养条件下，与对照相比bak1-4/bkk1-1双重突变体在萌发后4 d并未观察到缺陷表型.然而在萌发后一周，突变体的茎端分生组织生长几乎完全停止.萌发后10 d，幼苗子叶开始出现早期衰老症状，并且当双重突变体生长在无菌培养基时，其纯合幼苗会出现自发性的严重的细胞死亡现象，并伴随防御基因如PR1、PR2和PR5的表达量升高.表明BAK1和BKK1参与到细胞死亡调控通路中.将SiBAK1过表达在细胞死亡双突变体bak1-3/bkk1-1中，通过观察发现转基因幼苗在22 ℃生长条件下生长3周，并未出现早期衰老的症状；13 d幼苗的台盼蓝染色结果也表明，在bak1-3/bkk1-1背景中过表达SiBAK1的转基因植株，其细胞死亡症状被显著抑制，表明SiBAK1和拟南芥的BAK1类似，也参与到了植物的细胞死亡调控通路中.SiBAK1是否与拟南芥的BAK1类似，可以和FLS2、模式识别受体PRRs结合并相互磷酸化引发植物免疫反应是下一步研究工作的研究方向.

拟南芥BAK1参与植物的生长发育以及免疫调控方面的研究已经非常深入.SiBAK1在模式植物拟南芥中的一系列实验结果表明，其与拟南芥BAK1在结构以及功能上都具有很高的相似度，为探究谷子中SERKs家族基因更多的功能提供了证据，将SiBAK1回补到谷子的BR受体突变体中探究其在谷子中的功能，并探索谷子中SERKs家族基因的功能.目前只探究了SiBAK1与油菜素内酯信号通路和细胞死亡通路，SiBAK1是否与拟南芥BAK1一样作为共受体与其他受体结合调控其它信号转导途径还有待进一步研究.