茶树精油的化学成分检测及其抑菌效果

牛彪，王玲，梁剑平，尚若锋，郝宝成，王学红，杨珍，刘宇

(中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，农业部兽用药物创制重点实验室，甘肃省新兽药工程重点实验室，甘肃 兰州 730050)

植物精油(essential oil)，是存在于植物中的一类具有芳香气味、可随水蒸气蒸馏出来而又与水不相混溶的挥发性油状成分的总称，是天然植物和香料的精华，是植物的次生代谢产物[1].精油组分较为复杂，常常由数十种到数百种化学成分组成，主要包括萜类、芳香族、脂肪族化合物[2].鉴于植物精油具有广谱抑菌杀菌、抗氧化、抗炎症和促生长的作用，同时具有耐药性低、残留量少及对食品安全的优势[3-6]，因此，常被开发利用为防腐剂及天然杀菌剂，并有望成为一种可缓解全球抗菌药物危机的天然抗菌剂[7].目前，对植物精油的研究多在分析其化学成分的基础上，抑菌机理的报道也日渐增多.

茶树精油(tea tree oil，TTO)是利用水蒸气蒸馏法从桃金娘科互叶白千层属的新鲜枝叶中提取出来的一种无色至淡黄色油状液体，具有怡人的芳香气味[8-9].茶树精油具有良好的广谱杀菌抑菌及保健作用，可抗病毒[10]、抗氧化[11]、抗炎症[12]、抗寄生虫[13]、促进伤口愈合[14]，是一种可替代抗生素的优良天然抗菌剂，无毒无公害.目前，茶树精油已广泛应用于基础医药卫生、日用化工、香料、食品、制药等行业[15].然而，由于引种困难及种植地域的差异性，对于茶树精油化学成分及抑菌机理的报道很少，加上价格比较昂贵，极大阻碍了茶树精油产品在我国的开发应用.本试验将利用GC-MS对茶树精油化学成分进行分析和鉴定，并对茶树精油进行体外抑菌活性及其对金黄色葡萄球菌抑菌机理的初步研究，为国内外茶树精油有效开发利用及新型天然食品防腐剂的研发提供一定的科学理论依据.

1 材料与方法

1.1 供试药物与菌株

试验药物：茶树精油，购自天津中澳嘉喜诺生物科技有限公司.按二甲基亚砜∶茶树精油=1∶19比例(V/V)配制精油乳剂5 mL(浓度843.6 mg/mL)，助溶剂二甲基亚砜在该比例条件下对供试菌株的生长无影响[16].对照药物：84消毒液，购自山东科斯特消毒科技有限公司.

试验菌株：大肠埃希氏菌(Escherichiacoli，CICC 10389)、白色念珠菌(Candidaalbicans，CICC 1965)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus，CICC 10384)、白色葡萄球菌(Staphyloccocusalbus，CICC 10897)、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa，CICC 10419)，由中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所农业部兽用药物创制重点实验室和甘肃省新兽药工程重点实验室提供.

1.2 仪器设备与试剂

HF-safe生物安全柜购自上海力申科学仪器有限公司；HNYC-202恒温培养振荡器购自天津欧诺仪器股份有限公司； Agilent 6890/5973气相质谱仪购自美国安捷伦科技公司；LDZX-50KBS立式压力蒸气灭菌器购自上海申安医疗器械厂；LGJ-10F真空冷冻干燥机购自北京松源华兴科技有限公司；Multiskan GO全波长酶标仪购自赛默飞世尔科技公司；jsm5600lv扫描电子显微镜购自日本电子株式会社(JEOL Ltd)公司；JY98-Ⅱ超声波细胞粉碎机购自宁波新芝生物科技股份有限公司；BT25S电子天平购自赛多利斯科学仪器(北京)有限公司产品.

改良马丁琼脂培养基、改良马丁肉汤培养基购自海博生物科技有限公司；营养肉汤、MH琼脂培养基、MH肉汤培养基购自北京奥博星生物技术有限责任公司；二甲基亚砜购自莱阳化工实验厂；正己烷(色谱级)购自天津市科密欧化学试剂有限公司；蛋白上样缓冲液购自新赛美生物科技有限公司；裂解液购自碧云天生物科技有限公司；微量BCA蛋白质定量试剂盒购自博士德生物；戊二醛购自阿拉丁试剂有限公司；无菌PBS购自北京索莱宝生物科技有限公司；试验所用其他试剂均为分析纯.

1.3 试验方法

1.3.1 气相色谱-质谱成分分析 结合相关文献[17]，并进一步优化条件：Agilent 6890/5973联用仪，石英毛细管柱(0.25 mm×50 m)，载气：高纯氦气，纯度≥99.999%；流速1.0 mL/min；进样量1 μL.分流进样，分流比：20∶1，进样口温度：250 ℃，升温程序：初始温度50 ℃，保持3 min；以5 ℃/min速率升至120 ℃，保持2 min；以10 ℃/min速率升至250 ℃，保持2 min；离子源温度230 ℃，电离电压：70 eV；四级杆温度：150 ℃，保持5 min；扫描模式：全扫描；扫描范围：50～650 m/Z.

1.3.2 体外抑菌试验 采用试管二倍稀释法及点种法测定茶树精油对大肠埃希氏菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌和绿脓杆菌的最小抑菌浓度MIC值(minimal inhibitory concentration，MIC)和最小杀菌浓度MBC(minimal bactericidal concentration，MBC).其次，通过管碟法(采用牛津杯加注茶树精油的体外抑菌法)观察其抑菌活性结果.稀释液为MH肉汤(mueller-hinton broth)或改良马丁肉汤培养基.

1.3.2.1 菌悬液的制备 将斜面保存的白色念珠菌菌种，常温放置约30 min，划线接种至改良马丁琼脂培养基，28 ℃恒温培养36～48 h；其余4种斜面保存菌株接种至MHA培养基(Mueller-Hinton Agar)，于37 ℃恒温培养箱培养20～24 h.从上述培养基上挑取单菌落制成肉汤悬液，无菌生理盐水1∶10稀释至0.5麦氏单位的供试菌悬液(相当于含菌1.0～1.5×108CFU/mL)，再用MH肉汤(mueller-hinton broth)或改良马丁肉汤1∶10稀释，使之含菌量为1.0×106CFU/mL，备用[18].

1.3.2.2 抑菌活性的测定(管碟法) 最佳涂布浓度的确定：用营养肉汤(细菌)或改良马丁肉汤(白色念珠菌)进行各活化菌液10-1～10-5的10倍递增稀释，取各稀释度菌液100 μL，涂布相应的琼脂平板，各稀释浓度做3个重复.细菌置37 ℃培养18～24 h，白色念珠菌置28℃培养36～48 h，观察菌苔生长状况，以确定各菌的最佳涂布浓度.

将制备的菌液用灭菌生理盐水稀释至最佳涂布浓度，15 min内，用灭菌棉签蘸取(挤出多余菌液)，均匀涂于平板上.平板加盖，放置超净工作台内干燥至少3 min，不超过15 min.夹取灭菌牛津杯(规格10 mm×8 mm×6 mm)，酒精灯微灼，于琼脂平板表面等距离放置3只牛津杯(1个供试药、1个阳性对照、1个阴性对照)，并在每只牛津杯中加入受试药液100 μL，即供试药茶树精油100 μL，阳性对照药10%的84消毒液100 μL，阴性对照组无菌生理盐水100 μL.合盖，平皿平置，于28℃培养36～48 h(白色念珠菌)，或置于37 ℃恒温培养20～24 h(细菌).用游标卡尺测量药物对5种病原菌的抑菌圈直径[19]，试验在相同条件下重复1次，2次结果应基本一致，否则不予报道.判定标准：抑菌环直径小于10 mm，为无抑菌作用；介于在10～15 mm，为抑菌作用较弱；大于20 mm，为具有较强抑菌作用.

1.3.2.3 最小抑菌浓度MIC值和最小杀菌浓度MBC值的测定(试管二倍稀释法) 将50支灭菌试管，10支一组分列为5排，编号.前4排每支试管中加入1 mL MH肉汤培养基，第5排每支试管中加入1 mL改良马丁肉汤培养基.分别吸取茶树精油乳剂1 mL，加入每排的第1号试管中.混匀管中的肉汤与药液，吸出1 mL至每排的2号管，依次类推，倍比稀释到10号管，从10号管吸出1 mL弃去，即可制成不同浓度的茶树精油乳剂.每支试管中分别加入3.8 mL相对应的肉汤培养基，每一排对应一个菌种，依次标注.每排1号管至7号管中的茶树精油浓度依次为：84.36、42.18、21.09、10.55、5.27、2.64、1.32 mg/mL.第8号管加入84消毒液，作同组阳性药物对照.9号管为不含药物的细菌生长对照管.10号管为不加药液和菌液空白对照.接种：吸取200 μL菌悬液于相应的试管中.将前4排接种细菌的试管，置于37 ℃恒温培养振荡器中振荡培养20～24 h.第5排接种白色念珠菌的试管，置于28 ℃恒温振荡培养箱中培养36～48 h.

将试验组和对照组各管内药物与细菌的培养物，混匀，吸取200 μL于相应的琼脂平板，用涂布棒涂匀，于相应温度、相应时间条件下进行培养.判定标准：菌落计数，平皿中菌落数≤5，则对应的茶树精油浓度为该菌的MIC值；将各试管继续在相应的温度下振荡培养24 h，按上述方法接种后，未出现菌落生长的最小精油浓度即为该菌的MBC值[20].各菌重复3次，求平均值.

1.3.3 生长曲线的测定 抑菌机理主要从茶树精油对金黄色葡萄球菌的抑制作用为研究内容进行.试验分为空白对照组、茶树精油处理组.将金黄色葡萄球菌培养至对数生长期，取出部分菌液，并用MHB培养基稀释至菌液浓度为1.0～5.0×106CFU/mL.向精油处理组中各自加入(1×MIC)、(2×MIC)茶树精油，空白对照组加入精油组(1×MIC)同等量的无水乙醇.每组3个重复.将空白组和精油组在37 ℃恒温振荡培养箱继续培养，每隔4 h取样5 mL，离心收集菌体，重悬于2 mL无菌PBS中，取200 μL于96孔板中用酶标仪在600 nm处测光密度值(D)[21]，连续测48 h.以培养时间为横坐标，D值为纵坐标，绘制生长曲线，分析茶树精油对金黄色葡萄球菌的抑制作用.

1.3.4 BCA试剂盒测蛋白含量 按“1.4.1”内容使金黄色葡萄球菌菌液浓度为1.0～5.0×106CFU/mL，在37 ℃恒温振荡培养箱继续培养，在4、8、12、24 h取样5 mL，离心收集菌体，用无菌PBS洗剂3次后，500 μL裂解液重悬，超声破碎后离心，收集上清.用微量BCA蛋白质定量试剂盒测蛋白浓度.

1.3.5 扫描电子显微镜观察试验 将培养至对数期的金黄色葡萄球菌稀释至浓度为1.0～5.0×106CFU/mL，分2组，空白组继续培养24 h，1×MIC茶树精油组分别在4、8、12、24 h取样5 mL，离心收集菌体，用无菌PBS洗剂3次后，再次离心收集菌体，用2.5%戊二醛，4 ℃固定12 h，梯度乙醇脱水(30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%)15 min后冷冻干燥，粘样镀金后观察菌体形态[22-24].

1.4 数据分析

2 结果与分析

2.1 茶树精油化学成分分析

茶树精油GC-MS化学成分总离子流图见图1，分析结果见表1.报告中显示出44个峰，鉴别出35种化合物，占总峰面积的99.49%.包括烯类(44.26%)、醇类(44.92%)、烷烃类(8.01%)、极少的酸和醚类.其中松油烯-4-醇(39.25%)、1,8-桉叶素(1.4%)，符合中华人民共和国国家标准关于互叶白千层(精)油，松油烯-4-醇[茶树(精)油]中松油烯-4-醇≥30%，1,8-桉叶素≤5%的规定.

图1 茶树精油GC/MS分析总离子流图Figure 1 Total ion current chromatogram of tea tree oil

表1 茶树精油气相色谱-质谱法分析结果

“-”表示未找到相应的分子式.“-” means that the molecular formula is not found.

2.2 茶树精油体外抑菌试验

茶树精油体外抑菌试验结果见表2.茶树精油对五种供试菌的抑菌圈直径介于18.51～28.24 mm之间，和10%的84消毒液杀菌效果相当甚至更强.MIC值在1.32～5.27 mg/mL之间，MBC在2.64～21.09 mg/mL之间.8号阳性对照管溶液变浑浊，有细菌生长，9号细菌生长对照管浑浊有细菌生长，10号空白对照管溶液澄清，无细菌生长.结果显示，茶树精油尤其对金黄色葡萄球菌表现出强烈的抑菌效果.因此，对于下文抑菌机理的研究主要以金黄色葡萄球菌为供试菌进行.

2.3 抑菌机理的研究

2.3.1 金黄色葡萄球菌生长曲线的测定 茶树精油对金黄色葡萄球菌的抑制效果见图2.从图中可以看出，空白组在28 h进入稳定期，此时菌液浓度最大，D值为1.511.1×MIC组在36 h时进入稳定期，此时菌液浓度最大，D值为1.328，相较对照组降低12.11%.2×MIC组抑制效果尤为明显，在培养20 h开始进入稳定期，在32 h时菌液浓度最大，此时D值为0.478，相较对照组降低68.37%，处于完全抑制状态.因此，一定浓度范围内茶树精油对金黄色葡萄球菌有较强的抑制效果.

表2 茶树精油体外抑菌试验

“-”表示没有抑菌效果.“-” means no bacteriostatic effect.

图2 金黄色葡萄球菌生长曲线Figure 2 Growth curve of Staphylococcus aureus

2.3.2 菌体总蛋白含量结果 茶树精油作用下菌体的总蛋白含量变化如图3，从图中可以看出：随着作用时间的增多，空白对照组从起初的336.75 μg/mL升至523.5 μg/mL；而浓度1×MIC的茶树精油组则从309 μg/mL降至56.3 μg/mL；浓度2×MIC的茶树精油组从324.25 μg/mL降至41.95 μg/mL，且降低的幅度明显大于1×MIC组.证实随着茶树精油浓度的增加，细菌更易因菌体总蛋白丧失而死亡.

2.3.3 扫描电子显微镜观察菌体形态试验 扫描电子显微镜观察茶树精油作用下金黄色葡萄球菌的表面形态变化，见图4.空白组菌体表面光滑规则、大小均一；茶树精油试验组部分菌体表面出现皱缩、破裂，且随作用时间的延长变形程度加剧，即菌体细胞受损程度与精油作用时间呈正比.电镜扫描图结果显示，部分菌体细胞细胞膜的完整性被严重破坏，引起细胞裂解，细胞内容物泄露，从而导致细胞死亡，达到抑菌的作用.

图3 茶树精油作用下菌体总蛋白变化Figure 3 Changes of total bacterial protein under the action of tea tree oil

3 讨论

本研究首先进行了茶树精油化学成分和体外抑菌试验的研究，得到了茶树精油含有44种物质，对金黄色葡萄球菌具有较好的抑菌活性.进而发现了茶树精油对金黄色葡萄球菌生长呈现浓度依赖性，2×MIC浓度茶树精油能完全抑制其生长.通过BCA法测定茶树精油作用下总蛋白的含量，即在茶树精油作用下，菌体蛋白质含量明显降低，也显示出浓度依赖性.结合SEM结果发现茶树精油对金黄色葡萄球菌抑菌作用位点可能位于细菌细胞膜上，由于细胞膜的完整性被严重破坏，引起细胞裂解，细胞内容物泄露，从而导致细胞死亡.然而，由于茶树精油是混合物，未能定量的对主要抑菌物质进行抑菌机理的阐述，而是从整体出发，来阐述其抑菌的根本原因，是本研究的不足之处.在今后的研究中，首先应确定茶树精油的主要抑菌成分，进而对主要抑菌成分进行定量研究，或从单体角度来探究茶树精油的抑菌机理，如此，才更具有合理性及科学性.

1：空白组菌体形态；2、3、4、5：分别为茶树精油作用4 h、8 h、12 h、24 h菌体形态.1 was morphology of the blank group；2,3,4 and 5 were fungal morphology of tea tree oil treated for 4,8,12 and 24 hours respectively.图4 扫描电子显微镜下金黄色葡萄球菌形态Figure 4 Morphology of Staphylococcus aureus under scanning electron microscopy

4 结论

1) 利用GC-MS剖析了茶树精油的化学成分，显示出44个峰，鉴别出35种化合物，占总峰面积的99.49%.包括烯类(44.26%)、醇类(44.92%)、烷烃类(8.01%)、极少的酸和醚类.

2) 茶树精油对革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌)、革兰氏阴性菌(大肠杆菌、绿脓杆菌)、真菌(白色念珠菌)均具有一定的抑制作用，其中MIC在1.32～5.27 mg/mL之间，MBC在2.64～21.09 mg/mL之间.

3) 利用生长曲线、BCA试剂盒法测菌体总蛋白、SEM方法，初步探讨了茶树精油对金黄色葡萄球菌的抑菌机理，发现茶树精油对金黄色葡萄球菌抑菌作用位点可能位于细菌细胞膜上，由于细胞膜的完整性被严重破坏，引起细胞裂解，细胞内容物泄露，从而导致细胞死亡.