有氧运动通过激活APP∕PS1小鼠大脑皮质和海马组织PI3K∕Akt信号通路抑制神经细胞凋亡

房国梁 赵杰修 张漓 李良 李鹏飞

国家体育总局体育科学研究所（北京100061）

阿尔茨海默症（Alzheimer's disease，AD）又称老年痴呆症，是一种多发于老年人，以进行性认知功能障碍和记忆力衰退为主要临床特征的神经系统退行性疾病[1]。该病最为典型的病理学特征为脑内老年斑（senile plaque，SP）的出现[2]、神经纤维缠结（neurofbrillary tangles，NFTs）的形成[3]以及神经元的大量丢失[4]等。

研究发现磷脂酰肌醇3 激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）∕蛋白激酶B（Protein kinase B，PKB∕Akt）信号通路能够调控神经细胞凋亡，在AD发生发展过程中具有重要作用[5]。PI3K由催化亚基p110和调节亚基p85 组成。p110 亚基能够催化4，5 二磷酸肌醇（phosphatidylinositol-3，4-bisphosphate，PIP2）生成3，4，5三磷酸肌醇（phosphatidylinositol-3，4，5-trisphosphate，PIP3）[6]。生成的PIP3 招募磷酸肌醇依赖激酶1（phosphoinositide dependent kinase-1，PDK1）和Akt 至细胞膜，促使PDK1 磷酸化Akt Thr308 位点[7]，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体2（mammalian target of rapamycin complex 2，mTORC2）磷酸化Akt Ser473 位点[8]，完全激活Akt[9]。活化的Akt 可以磷酸化Bcl-2 相关促凋亡蛋白（Bcl-2 associated death promoter，Bad）Ser112∕136位点[10]、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）Ser184位点[11]，从而有效阻断Bad、Bax诱导的细胞凋亡。活化的Akt 还可以阻止含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Caspase-3）和Caspase-9的活化[12]，促进p53的失活[13]，阻止线粒体细胞色素C（Cytochrome C）的释放[14]，从而起到抑制神经细胞凋亡的作用。

大量研究表明，长期有规律的体育运动能够有效延缓AD的发生，但其机制尚不明确。我们在前期的研究中已发现有氧运动能够提高普通大鼠和肥胖大鼠大脑皮质和海马组织PI3K∕Akt通路活性[15，16]，并且有氧运动对抑制神经细胞凋亡有积极作用[16]。但是有氧运动是否通过激活PI3K∕Akt 通路调控神经细胞凋亡，目前国内外尚未见报道。因此，本研究利用PI3K∕Akt 特异性抑制剂GNE-317 抑制APP∕PS1 转基因小鼠脑中PI3K∕Akt信号通路活性，观察8周有氧运动后小鼠大脑皮质和海马组织中各细胞凋亡因子的变化情况，以揭示有氧运动抑制神经细胞凋亡的作用机制，为阐明有氧运动延缓AD发生提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物饲养及分组

40 只8月龄 雄 性APP∕PS1 转基 因 小鼠，体 重 为30.15 ± 3.43 g，购自中科泽晟生物科技有限公司。每笼2 只小鼠，自由进食饮水，光照比为12 h∶12 h，温度20℃± 2 ℃，相对湿度40%～60%。在适应性饲养1 周后，随机分为4 组，安静组（T-SE，n=10）、运动组（T-EX，n=10）、GNE-317处理安静组（T-SEG，n=10）和GNE-317处理运动组（T-EXG，n=10）。

1.2 训练方案

所有小鼠先进行5 天的跑台适应性训练，每天训练10 min，速度9 m∕min。休息2 天后，T-EX 和TEXG 组小鼠按表1中的方案进行为期8 周的正式训练。在8 周时间内跑台速度从12 m∕min 增至15 m∕min，通过动物气体代谢分析系统测定相当于74%～79% VO2max 负荷强度，训练时间从30 min 增至60 min，跑台坡度为0o。每周一至周五训练，周六、日休息。T-SE和T-SEG组小鼠则一直处于安静状态。

表1 8周跑台训练方案

1.3 给药方案

在适应性训练结束以后，T-SEG 和T-EXG 组小鼠给予GNE-317 处理。GNE-317 是一种特异的PI3K∕Akt 信号通路抑制剂，可以穿透血脑屏障，显著抑制小鼠脑中Akt 的磷酸化，具有高效、长久、低毒的特点[17，18]。将GNE-317按照每只小鼠30 mg∕kg∕天的剂量通过灌胃方式给药8周[17，18]。

1.4 样品制备

在最后一次训练结束后48 h，所有小鼠用10%水合氯醛溶液腹腔麻醉，然后断头取脑，在冰上迅速分离相同部位大脑皮质和两侧海马组织。每只小鼠一部分大脑皮质和同侧海马组织做Western blot实验，立即放入液氮冷冻，然后转入－80℃冰箱中保存待测。另一部分大脑皮质和另一侧海马组织做TUNEL（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling）染色，取材清洗后立即放入4%多聚甲醛固定液中进行固定，然后石蜡包埋和切片。

1.5 TUNEL染色

小鼠大脑皮质和海马组织石蜡切片脱蜡水化，每个蜡块选取5张切片。PBS洗涤后，将切片置于20 μg∕mL 不含DNase 的蛋白酶K 溶液中，室温孵育30 min。PBS 洗涤5 min×3，然后加入3% H2O2溶液，室温孵育10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性。将切片置于含有0.1% Triton X-100 的PBS 溶液中通透15 min。然后在切片上滴加含有TdT 酶和生物素的TUNEL 检测液，37℃避光孵育60 min。PBS 洗涤后，在切片上滴加终止液，室温孵育10 min。PBS 洗涤5 min×3，然后在切片上滴加链霉亲和素-HRP工作液，室温孵育30 min。PBS 洗涤5 min×3，再在切片上滴加DAB显色液，室温孵育10 min。PBS 洗涤5 min×3，用苏木素染色液进行细胞核染色。PBS洗涤5 min×3，然后封片观察。每张片子随机选择10 个视野计算TUNEL 染色阳性细胞数量平均值。

1.6 Western blot实验

将小鼠大脑皮质和海马组织在液氮中研磨后，迅速加入含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA 蛋白裂解液进行细胞组织的充分裂解。4℃，12000 ×g离心15 min，取200 μL 上清液然后加入50 μL 5×蛋白上样缓冲液，放入100℃水浴锅中进行蛋白变性，持续10 min。然后进行SDS-PAGE 电泳，电泳后将蛋白转至硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭膜1 h，然后将膜与稀释好的一抗4 ℃孵育过夜（实验中用到的一抗PI3K p110、PI3K p85 抗体购自Cell Signaling Technology 公司；Akt、Phospho-Akt Thr308、Phospho-Akt Ser473、Bcl-2、Bad、Bax、Cleaved Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9、Cytochrome C 和β-actin 抗体购自Beyotime公司）。次日用TBST洗膜5 min×3，洗去残留一抗，然后将膜与稀释好的二抗室温孵育1 h（实验中用到的二抗HRP 标记山羊抗兔IgG 和HRP 标记山羊抗小鼠IgG 购自Beyotime 公司），然后用TBST 洗膜5 min×4，以洗去残留的二抗。最后使用ECL化学发光试剂和X光片检测蛋白信号。

1.7 数据统计

使用Image J软件进行Western blot条带的灰度分析，应用SPSS 19.0软件进行统计学分析。将运动方式和GNE-317给药作为组间主效应，进行双因素方差分析，若有交互作用，采用LSD简单效应检验，若无交互作用，则采用独立样本t检验。文中所有统计数据为3次独立实验结果的平均值± 标准差，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 有氧运动和GNE-317对PI3K/Akt信号通路的影响

从图1中可以发现，T-EX 组小鼠大脑皮质PI3K p110 和p85 亚基的蛋白含量与T-SE 组相比均显著上升，分别约为T-SE组的1.56倍和1.61倍（P＜0.01）。而在GNE-317 处理8 周后，T-SEG 组和T-EXG 组PI3K p110和p85亚基的蛋白含量分别与T-SE组和T-EX组相比并无显著差异。

各组小鼠大脑皮质中Akt 总蛋白含量并没有发生显著改变。而T-EX 组Thr308 和Ser473 位点的磷酸化水平与T-SE 组相比显著上升，分别约为T-SE 组水平的1.56 倍和1.76 倍（P＜0.01）。GNE-317 处理8 周后，T-SEG 组和T-EXG 组Thr308 和Ser473 位点的磷酸化水平分别与T-SE 组和T-EX 组相比均显著下降，其中T-SEG 组Thr308 和Ser473 位点的磷酸化水平分别为T-SE 组水平的61.34%和62.39%（P＜0.05），而T-EXG组Thr308 和Ser473 位点的磷酸化水平分别为T-EX 组水平的61.67%和59.96%（P＜0.01）。

另外，我们在前期的研究中已探究8 周有氧运动和GNE-317对APP∕PS1小鼠海马组织PI3K∕Akt通路的影响[19]。

图1 8周有氧运动和GNE-317对APP∕PS1小鼠大脑皮质PI3K∕Akt通路蛋白表达的影响（n=10）

2.2 PI3K/Akt通路对有氧运动抑制神经细胞凋亡的影响

如图2所示，在T-SE、T-EX、T-SEG 和T-EXG 组小鼠大脑皮质中，TUNEL 染色阳性细胞数量分别为198 ± 26 个∕mm2、107 ± 24 个∕mm2、294 ± 31 个∕mm2和207 ± 29 个∕mm2（图2A、B）；海马组织中TUNEL 染色阳性细胞数量分别为241 ± 38个∕mm2、125 ± 19个∕mm2、364 ± 35个∕mm2和224 ± 29个∕mm2（图2C、D）。

2.3 PI3K/Akt通路对有氧运动调控神经细胞凋亡因子的影响

从图3A 中可以看出，经过8 周的有氧运动后，TEX组小鼠大脑皮质中抗凋亡因子Bcl-2的水平显著高于T-SE 组，约为T-SE 组水平的1.56 倍（P＜0.05，图3B）；促凋亡因子Bad、Bax、Cytochrome C、Caspase-9、Caspase-7和Cleaved Caspase-3的含量显著下降，分别约为T-SE 组水平的54%（P＜0.05，图3C）、56%（P＜0.05，图3D）、42%（P＜0.01，图3E）、45%（P＜0.01，图3F）、51%（P＜0.01，图3G）和61%（P＜0.05，图3H）。

而GNE-317 处理8 周后，T-SEG 和T-EXG 组抗凋亡因子Bcl-2 的水平分别与T-SE 和T-EX 组相比显著降低，而促凋亡因子Bad、Bax、Cytochrome C、Caspase-9、Caspase-7和Caspase-3的水平分别与T-SE和T-EX组相比均显著上升。其中T-SEG 组Bcl-2、Bad、Bax、Cytochrome C、Caspase-9、Caspase-7 和Cleaved Caspase-3 的水平分别约为T-SE 组水平的52%（P＜0.05，图3B）、1.62 倍（P＜0.01，图3C）、1.74 倍（P＜0.01，图3D）、1.84 倍（P＜0.01，图3E）、1.62 倍（P＜0.01，图3F）、1.78 倍（P＜0.01，图3G）、1.58 倍（P＜0.01，图3H）。TEXG 组Bcl-2、Bad、Bax、Cytochrome C、Caspase-9、Caspase-7 和Cleaved Caspase-3 的水平分别约为T-EX 组水平的69%（P＜0.05，图3B）、1.57 倍（P＜0.05，图3C）、1.41倍（P＜0.05，图3D）、2.33倍（P＜0.01，图3E）、1.75倍（P＜0.01，图3F）、1.80 倍（P＜0.05，图3G）、1.59 倍（P＜0.01，图3H）。

图2 APP∕PS1小鼠大脑皮质和海马组织TUNEL染色（×400，n=10）

图3 8周有氧运动和GNE-317对APP∕PS1小鼠大脑皮质细胞凋亡因子的影响（n=10）

从图4A 中可以看出，经过8 周的有氧运动后，TEX组小鼠海马组织中抗凋亡因子Bcl-2的水平显著高于T-SE 组，约为T-SE 组水平的1.89 倍（P＜0.01，图4B）；促凋亡因子Bad、Bax、Cytochrome C、Caspase-9、Caspase-7和Cleaved Caspase-3的含量显著下降，分别约为T-SE 组水平的47%（P＜0.01，图4C）、56%（P＜0.01，图4D）、51%（P＜0.01，图4E）、44%（P＜0.01，图4F）、61%（P＜0.01，图4G）和57%（P＜0.01，图4H）。而GNE-317 处理8 周后，T-SEG 和T-EXG 组抗凋亡因子Bcl-2的水平与T-SE和T-EX组相比显著降低，而促凋亡因子Bad、Bax、Cytochrome C、Caspase-9、Caspase-7和Cleaved Caspase-3 的水平与T-SE 和T-EX 组相比显著上升。其 中T-SEG 组Bcl-2、Bad、Bax、Cytochrome C、Caspase-9、Caspase-7 和Cleaved Caspase-3的水平分别约为T-SE 组水平的58%（P＜0.05，图4B）、1.67倍（P＜0.01，图4C）、1.54倍（P＜0.01，图4D）、1.79倍（P＜0.01，图4E）、1.59 倍（P＜0.01，图4F）、1.54 倍（P＜0.01，图4G）、1.67 倍（P＜0.01，图4H）。T-EXG 组Bcl-2、Bad、Bax、Cytochrome C、Caspase-9、Caspase-7 和Cleaved Caspase-3 的水平分别约为T-EX 组水平的51%（P＜0.01，图4B）、1.66 倍（P＜0.05，图4C）、1.50 倍（P＜0.05，图4D）、1.84 倍（P＜0.05，图4E）、1.91 倍（P＜0.05，图4F）、1.41倍（P＜0.05，5图4G）、1.42倍（P＜0.05，图4H）。

图4 8周有氧运动和GNE-317对APP∕PS1小鼠海马组织细胞凋亡因子的影响（n=10）

3 讨论

神经元的大量丢失是AD 病人脑中最为典型的病理特征之一，研究表明主要以神经细胞凋亡的形式发生[20]。细胞凋亡是细胞程序性死亡，受多种基因的共同调控，如Bcl-2 家族、Caspase 家族、C-myc、p53 等。Bcl-2 家族拥有众多成员，如Bcl-2、Bax、Bak、Bad、Bim等，其中Bcl-2属于抗凋亡因子，而Bax、Bak、Bad和Bim属于促凋亡因子。在DNA 断裂、氧化损伤以及癌基因活化等因素作用下，Bax、Bak等促凋亡因子改变了线粒体膜的通透性，使线粒体内的细胞色素C 得以进入细胞质[21]。释放到细胞质中的细胞色素C 在ATP 作用下与衔接蛋白Apaf-1结合形成多聚体，并促使Caspase-9与其结合形成凋亡小体[22]，进一步激活下游Caspase-7、Caspase-6、Caspase-3 等众多蛋白，最终引起细胞凋亡。而Bcl-2具有抑制Bax和Bak的作用。

越来越多的研究表明，运动能够延缓神经细胞凋亡。Baek等[23]研究发现4周的跑台训练就可以提高AD模型大鼠海马组织抗凋亡因子Bcl-2含量，降低促凋亡因子Bax 含量，同时减少Caspase-3 阳性细胞数量。我们在前期的研究中也发现12 周的跑台训练能够显著提高老年大鼠大脑皮质和海马组织中Bcl-2的含量，降低Bax、Cytochrome C 以及Cleaved Caspase-3 的含量，对于抑制神经细胞凋亡有积极作用[16]。

而PI3K∕Akt信号通路对于细胞凋亡具有重要调控作用，活化的Akt 可以磷酸化Bad Ser112∕136 位点[10]、Bax Ser184位点[11]，从而有效阻断Bad、Bax诱导的细胞凋亡。同时活化的Akt 还可以阻止Caspase-3 和Caspase-9 的活化[12]，促进p53 的失活[13]，阻止线粒体细胞色素C 的释放[14]。本实验发现有氧运动在抑制神经细胞凋亡过程中伴有PI3K∕Akt 信号通路活性的提高[16]。因此，我们推测有氧运动抑制神经细胞凋亡很可能是通过激活PI3K∕Akt信号通路发挥作用的。

为了证明上述推测，我们选择了APP∕PS1 转基因小鼠作为模型动物。这是一种广泛使用的AD 症模型小鼠，其脑内可表达突变的人类早老素和人鼠淀粉样前蛋白融合体，导致早发性老年痴呆症[24]。同时我们利用PI3K∕Akt 信号通路特异性抑制剂GNE-317，通过灌喂的方式处理8 周，抑制小鼠脑中PI3K∕Akt 通路活性。GNE-317 可以穿透血脑屏障，抑制Akt Thr308 位点和Ser473 位点的磷酸化水平[17，18]。经过8 周的跑台训练后，我们发现运动组小鼠大脑皮质和海马组织中PI3K p110 和p85 亚基的蛋白含量显著提高，并且Akt Thr308和Ser473位点的磷酸化水平也显著提高；同时，TUNEL 染色阳性细胞数量显著减少；进一步发现抗凋亡因子Bcl-2 含量上升，促凋亡因子Bad、Bax、Cytochrome C、Caspase-9、Caspase-7 和Cleaved Caspase-3的含量均下降。上述结果说明有氧运动能够提高APP∕PS1小鼠大脑皮质和海马组织PI3K∕Akt信号通路活性，有效抑制神经细胞凋亡。而T-SEG 和T-EXG 两组在经过GNE-317处理8周后，其PI3K p110和p85亚基以及Akt 的总蛋白含量均没有发生显著变化，但是对Akt Thr308和Ser473位点的磷酸化水平有明显的抑制作用，抑制效率能达到60%，这与文献中报道的效率相似[17，18]。随后我们发现GNE-317处理组TUNEL染色阳性细胞数量显著多于未处理组，抗凋亡因子Bcl-2含量显著下降，促凋亡因子Bad、Bax、Cytochrome C、Caspase-9、Caspase-7 和Cleaved Caspase-3 的含量显著上升。这表明在PI3K∕Akt 信号通路受到抑制的情况下，有氧运动抑制神经细胞凋亡的作用减弱。

4 结论

综上所述，有氧运动通过增强APP∕PS1 小鼠大脑皮质和海马组织中PI3K∕Akt 信号通路活性，提高了抗凋亡因子Bcl-2 的含量，同时降低促凋亡因子Bad、Bax、Cytochrome C、Caspase-9、Caspase-7 和Cleaved Caspase-3的含量，从而有效抑制神经细胞凋亡。而抑制PI3K∕Akt 信号通路活性，有氧运动抑制神经细胞凋亡的作用减弱。因此，有氧运动对于预防阿尔茨海默症具有积极作用。