运动对雄性小鼠骨内分泌FGF23—Klotho∕FGFR1轴及相关因子表达的影响

徐帅 李世昌 陈祥和

1 淮阴师范学院体育学院（淮安223300）

2 华东师范大学体育与健康学院（上海200241）

3 扬州大学体育学院（扬州225127）

骨骼具有支持、保护、运动等功能，也是其他激素的靶器官。随着研究深入，骨内分泌系统（bone endocrine system）观念得到认可，将骨骼由被动接受器官转变为主动调节组织，提出骨分泌的调节地位。研究发现，骨骼分泌源激素包括：骨钙素（osteocalcin，OCN）、脂质蛋白2（lipocalin 2，LCN2）和成纤维细胞生长因子23（fibroblast growth factor 23，FGF23）共3 种。FGF23 作为调节磷酸盐和维生素D 的骨源性激素，由成骨细胞和骨细胞分泌，经血液循环转移至肾脏组织。体外研究证实，FGF23 和受体Klotho 结合会降低成骨细胞分化和矿化水平[1]，在其受体Klotho的协同作用下与成纤维细胞生长因子受体1（fibroblast growth factor receptor 1，FGFR1）共结合，能够调节磷（phosphorus，P）水平和1，25二羟维生素D3[1，25（OH）2D3]活性，提高肾脏对磷的排泄，维持血磷正常水平[2，3]，而骨骼损伤会引起机体产生高钙血症和高磷酸盐血症[4]。FGF23磷化活性主要抑制磷酸盐重吸收，使尿磷酸盐增多并降低血磷水平。FGF23 通过作用于Klotho-FGF 受体（Klotho-FGF Receptor，FGFR），进一步下调肾脏近端小管内钠依赖性磷酸盐转运子2a（Na+-dependent phosphate co-transporter 2a，NPT2a）和钠依赖性磷酸盐转运子2c（Na+-dependent phosphate co-transporter 2c，NPT2c）表达，抑制血磷重吸收。FGF23 在调节1，25（OH）2D3变化水平中的体现在：（1）抑制1α-羟化酶表达，其中1α-羟化酶由Cyp27b1基因编码；（2）诱导24-羟化酶表达，其中24-羟化酶由Cyp24α1 基因编码；1α-羟化酶表达降低和24-羟化酶表达升高引起1，25（OH）2D3水平减弱[5]。1，25（OH）2D3与FGF23构成负反馈调节机制，注射FGF23 会引起1，25（OH）2D3的减弱，而注射1，25（OH）2D3 则会导致FGF23 的增加。

本研究基于整合生物学视角，将骨骼调控水平与肾脏功能进行连接，从运动角度出发，探讨多器官交互作用。本研究通过构建不同运动模型小鼠，讨论运动调节骨分泌源激素变化，为运动促进肾脏分泌功能提供数据支持，为了解运动改善慢性肾脏病的发生发展提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级5 周龄C57BL∕6 雄性生长期小鼠28 只，购自于上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物许可证号码为SCXX（沪）2012-0002，初始体重为18.19± 0.26 g。适用性饲养1 周后，随机分成对照组（control group，C 组）、跳跃组（jumping group，J 组）、游泳组（swimming group，S 组）和下坡跑组（downhill running group，R组）各7只，自由饮用矿物质水。小鼠在华东师范大学体育与健康学院清洁级动物房（独立顺风系统）饲养，室内保持恒温、恒湿，生活环境昼夜比为1∶1（24 h）。每周运动6 天、共8 周，运动强度在65%～70%VO2max。第1 周进行适应性训练，第1、2天为20 min，第3、4 天为35 min，第5、6 天为50 min，之后则每天进行50 min训练。跳跃组跳跃频率为6～7 次∕min；游泳组游泳装置（长×宽×高100 cm×60 cm×80 cm），水深40 cm，温度保持32℃± 2℃；下坡跑组运动跑台坡度为－9°，跑速为0.8 km∕h（见图1）。实验方案获得华东师范大学动物实验伦理委员会审批，伦理审查编号为：M20171202。

图1 运动装置

1.2 实验动物取材

最后一次训练结束后，24 h内处死，用精密度称重仪称取小鼠体重、右侧股骨湿重和右侧胫腓骨湿重；眼球取血后备用取血清；取肾脏组织。所有操作于冰上进行，于－80℃超低温冰箱存置，待测。

1.3 Western blotting检测

称取40 mg骨组织测FGF23；称取40 mg肾脏组织测Klotho 和FGFR1，待测组织分别进行检测。加入210 μl RIPA 裂解液（含磷酸酶抑制剂），用钢珠进行匀浆研磨；结束后，冰上静敷30 min，再以20 min、12000 g、4℃进行离心，取上清；用BCA 试剂盒测定蛋白浓度；设置0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg∕ml的标准品浓度，配置成20 μl 体系，每个体系中加入200 μl BCA 溶液，摇匀后放入37℃恒温干燥箱中，预热30 min；预热后，在5 min 内利用多功能酶标仪在562 nm吸光度下进行OD值的测量，根据浓度差异，分别加入不同含量SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液（2X）和PBS。用SDS-PAGE 进行凝胶电泳，采用湿膜法先80 V、再120 V 电泳，100 V 转膜80 min，取膜、丽春红染色、洗膜、封闭2 h、洗膜、孵一抗（小鼠源1∶1000）过夜12 h、洗膜3 次各5 min、孵二抗（抗小鼠1∶1500）2 h、洗膜3次；于暗室ECL显影，用Aipha成像系统扫膜，并用Image Studio软件进行灰度值分析，将目的蛋白与内参进行比较计算。其中FGF23 抗体购于Affinity 公司、Klotho 抗体购于abcam 公司、FGFR1 抗体购于CST公司、内参GAPDH抗体购于abcam公司。

1.4 RT-PCR检测

主要包括4 步：（1）RNA 的提取。取肾脏组织，研磨后移入EP管中，加RNAiso PLUS提取；（2）RNA浓度测定和纯度分析；（3）RNA 反转录。RNA 反转录试剂盒反转录为cDNA，再测定cDNA 浓度；（4）RT-PCR 扩增。ABI StepOne 型实时荧光定量PCR 仪检测相关基因表达量，记录Ct值，根据内参样品值和待测样品值计算基因mRNA 的相对表达量，计算公式为2-△△Ct计算法。所有引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成（见表1）。

表1 引物序列表

1.5 无机磷测定

血液4℃过夜，以20 min、4000 g、4℃离心取血清，磷测试盒（带标准）磷钼酸法实验分4 步：（1）取0.1 ml血清加0.4 ml 沉淀剂，混匀后离心10 min 取上清；（2）按照20 μl 待测上清液加200 μl 工作液，并设置标准管和空白管；（3）37℃水浴30 min，冷却至室温，波长660 nm，测定吸光度；（4）磷含量（mmol∕l）=（测定OD值－空白OD值）∕（标准OD值－空白OD值）×标准品浓度（0.5 mmol∕l）×样品处理稀释倍数（5 倍）。无机磷测试盒购于南京建成生物工程研究所。

1.6 酶联免疫分析

血液4℃过夜，以20 min、4000 g、4℃离心取上清，设置标准品孔和样品孔，各50 μl（待测样品10 μl 和稀释液40 μl），加入酶标试剂100 μl，37℃温育60 min，去液，洗涤5 次，30 s∕次，加入显色剂，37℃避光15 min，加终止液，450 nm 波长依次测量各孔OD 值。其中1，25（OH）2D3购于上海酶联生物。

1.7 统计学方法

本研究实验数据，均采用平均数±标准差（±s）表示，利用Excel 和SPSS19.0 对实验数据进行统计分析，组间采用单因素方差分析。其中P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 运动对小鼠体重、单侧股骨湿重和胫腓骨湿重的影响

由表2可见，游泳组体重低于对照组和下坡跑组（P＜0.05）；跳跃组和下坡跑组单侧股骨湿重高于对照组（P＜0.05）；跳跃组和下坡跑组单侧股骨湿重高于游泳组（P＜0.01）；各组间单侧胫腓骨湿重无显著变化。统一单位后，计算其骨湿重与体重变化，跳跃组和下坡跑组股骨湿重∕体重水平高于对照组（P＜0.01）；胫腓骨湿重∕体重水平无显著差异。

表2 运动对小鼠体重、股骨和胫腓骨湿重的影响（n=7）

2.2 运动对骨中FGF23、肾脏中Klotho和FGFR1蛋白表达的影响

由图2可见，跳跃组、游泳组和下坡跑组骨组织FGF23 蛋白相对表达量高于对照组（P＜0.05 或P＜0.01）。各组肾脏Klotho蛋白相对表达量没有显著性差异。下坡跑组肾脏FGFR1蛋白相对表达量高于对照组（P＜0.05）。

图2 运动对相关蛋白表达的影响

2.3 运动对肾脏中NPT2a、NPT2c、Cyp24α1 和Cyp27b1 mRNA表达的影响

由图3可见，下坡跑组NPT2a mRNA 表达水平低于对照组（P＜0.05）；各组肾脏NPT2c mRNA 表达水平无显著差异；跳跃组和下坡跑组Cyp24α1 mRNA 表达水平高于对照组（P＜0.01），下坡跑组Cyp24α1 mRNA表达水平高于游泳组（P＜0.01）；下坡跑组Cyp27b1 mRNA表达水平低于对照组（P＜0.05）。

图3 运动对NPT2a、NPT2c、Cyp24α1 和Cyp27b1 mRNA表达的影响

2.4 运动对血磷和1，25（OH）2D3的影响

由图4可见，游泳组和下坡跑组血磷水平低于对照组（P＜0.01）；跳跃组、游泳组和下坡跑组血清1，25（OH）2D3含量低于对照组（P＜0.05或P＜0.01）。

图4 运动对血清指标的影响

3 分析与讨论

3.1 运动对小鼠体重和骨湿重的影响

规律性运动能够有效减少脂肪含量，减轻体重，提高肌肉和骨骼质量[6]。本研究采用的运动方式，能更为有效地提高骨骼质量。研究发现，经过8 周的运动干预，运动组体重均低于对照组，但是在股骨湿重变化上，跳跃组和下坡跑组明显高于对照组，胫腓骨湿重之间则不存在显著性差异。在股骨湿重∕体重、胫腓骨湿重∕体重的变化上，运动后，运动组骨骼比重远高于对照组，也符合上述骨骼质量变化。整体而言，下坡跑组变化最为显著，说明8 周的直接应力刺激可显著提高小鼠股骨湿重，而游泳所产生的间接应力反而没有对股骨湿重起到直接刺激作用。在应力刺激中有研究指出，50%的负荷跑台训练，可有效提高老龄Wistar 大鼠的股骨湿重，低于（30%）或者超过（70%）该强度都不会显著提高骨骼质量[7]，过大强度的应力刺激甚至会导致骨微环境损伤。本研究认为，下坡跑运动与负重训练具有异曲同工之妙，且下坡跑运动的可操作性更强，尤其是对于刺激骨骼发生发展具有直接反馈性作用。

3.2 运动对FGF23、Klotho和FGFR1蛋白表达的影响

骨骼成分主要为钙磷化合物，当机体内出现钙磷紊乱现象，一方面，骨骼通过自身的骨转换改善钙磷平衡；另一方面，通过骨骼内分泌因子与肾脏成纤维生长因子受体（fibroblast growth factor receptors，FGFRs）结合，调节磷吸收水平。但是FGFRs 与FGF23 的结合水平低，需要Klotho 先与FGFRs 结合，形成Klotho∕FGFR1 复合物，再与FGF23 结合发挥作用。FGF23 作为骨分泌性“调磷因子”，其分子量仅为23 KD，能够迅速穿过骨陷窝—骨小管网络系统，进入毛细血管，最终直接到达远端器官和细胞；在骨骼内分泌过程中，FGF23低表达或高表达均会引起骨骼代谢紊乱[8]。在肾脏中，FGF23抑制近曲小管对磷的重吸收和维生素D的再合成，从病理生理学角度，缺乏FGF23或Klotho的小鼠表现出：尿磷排泄受损引起磷酸盐潴留；1，25（OH）2D3的合成增多和降解减慢导致的维生素D 中毒[5]。在肾病综合征患者中，骨骼FGF23 分泌水平减少会导致较低的维生素D水平以及尿失禁等症状[1]。本研究发现，运动能够有效提高骨骼FGF23 分泌，尤其以下坡跑运动最为突出，长期运动会提高骨骼FGF23 合成以及血液循环中FGF23水平。研究还发现，在急性、力竭性和长期耐力运动下，均会提高血清FGF23 水平，考虑到FGF23 mRNA还可在肝脏、心脏、骨骼肌等多种器官中表达[9]，而且长期规律运动会提高骨骼质量和分泌能力。由此可认为，短时间运动干预，虽然会显著改善血液FGF23水平，但并不涉及到骨骼分泌程度的改变，只有在长期效果下，运动才会明显改善骨骼内环境，提高FGF23循环水平，整体性改变血清FGF23水平。

FGF23 生物活性需要介质Klotho，其中FGF23 和Klotho共缺陷小鼠由于维生素D中毒出现衰老表征，当FGF23或Klotho缺陷时，小鼠会出现肾近曲小管1α-羟化酶过表达，导致维生素D[1，25（OH）2D3]高度生成；而FGF23 和Klotho 缺陷小鼠，1，25（OH）2D3 循环水平极度升高，引起高血钙症和高磷酸盐血症[4]。本研究发现，在Klotho调节中，不同运动方式对于其蛋白表达并没有显著性改善。分析认为，一方面，受体本身的调节并不是影响下游因子变化的主要问题；另一方面，高FGF23 水平对Klotho 调节还存在一定的抑制作用，其中高磷、低维生素D 和高FGF23 表达，会负性调节Klotho 表达，并积极诱导骨骼中FGF23 合成[10]。Klotho是作为一种抗衰老基因[10]，Klotho主要以膜型和分泌型2 种蛋白形式存在，其中膜型Klotho 会与FGF23 共结合，而分泌型Klotho（sKlotho）独立于FGF23，在血液、尿液和脑脊液中可检测到分泌型Klotho 蛋白。由于Klotho 具有延长寿命的效果，Klotho 缺失会引起早衰，而运动会改变基因表达。研究发现，急性有氧运动会显著增加血液Klotho循环水平；同样的，在久坐不动的年轻或老年女性中，急性有氧运动同样会改变血液Klotho 循环水平；且长期有氧运动也会提高Klotho 循环。这些研究表明，Klotho 上调与运动存在必然联系[11]，也从侧面证实了运动延缓衰老。

FGFR1 可在肾小管、脉络丛、睾丸、窦房结以及骨组织等少数几个组织中表达，FGFR1-∕-小鼠出现FGF23高表达、肠刷状缘膜囊泡（brush-border membrane vesicle，BBMV）磷酸盐转运水平增加，并提高NPT2c蛋白表达[12]。在FGFR1 运动干预中，运动会提高Klotho 与FGFR1结合率，通过8周运动干预，发现运动会提高肾脏中FGFR1 表达水平，尤其以下坡跑运动效果最佳。本研究认为，运动会改善机体内FGFR1合成水平，对于维持机体血磷稳态等具有良好的调控。Krajisnik 等[13]发现，在长期慢性肾脏病（CKD）中，肾脏FGFR1表达下降，观察到甲状旁腺Klotho 和FGFR1 表达量随着肾功能下降而下降，这与肾功能衰竭相关的矿物质代谢改变有关，也可以解释在晚期CKD 中观察到FGF23 的甲状旁腺抵抗现象，最终出现血清FGF23 升高的异常情况。在成年小鼠中利用单克隆FGFR1 抗体（R1MAb）激活FGFR1表达，会显著提高FGF23水平，同时出现低磷症状；在培养大鼠颅盖骨成骨细胞中，R1MAb 诱导FGF23 mRNA 表达和FGF23 蛋白表达；在培养肾上皮细胞系中，R1MAb 则充当功能性FGF23 模拟物并激活FGF23生成[14]。

3.3 运动对肾脏中NPT2a、NPT2c、Cyp24α1 和Cyp27b1 mRNA表达的影响

NPT2a 和NPT2c 突变与家族性低磷血症患者的肾实质结石（肾结石）和肾实质矿物质沉积（肾钙质沉着症）相关。在全基因组关联研究中，NPT2a与肾结石和肾功能改变有关。当这两种基因突变，表现出1，25（OH）2D高循环水平，以及吸收性高钙尿症。口服磷酸盐补充剂通过降低1，25（OH）2D和吸收性高钙尿症的循环水平，减少NPT2a 和NPT2c 突变携带者的肾矿化风 险[15]。NPT2a-∕-NPT2c-∕-小鼠和单独敲除NPT2a 或NPT2c 小鼠相比，双敲除小鼠的骨骼异常现象更为明显，表明两分子在磷酸盐稳态中具有类似的非冗余作用，基因敲除小鼠的体内血磷含量，80%由NPT2a 调节，20%由NPT2c 调节，研究指出NPT2a 和NPT2c 是由饮食、血磷和三类激素（PTH、1，25（OH）2D3和FGF23）共同调节[16，17]。在小鼠体内，NPT2a在肾脏磷吸收中占到70%～80%，而NPT2c 主要在断奶的动物中起到重要调节作用。成年动物体内，NPT2c 对肾脏磷吸收作用较弱，在人体内，NPT2c对肾脏磷吸收和骨骼矿化具有重要作用[16]。耐力运动会改善生长期慢性肾病大鼠骨骼质量[18]，在长期慢性肾脏病中，定期有规律运动训练会改善肾脏功能[19]。同时，Johansen[20]研究指出，肾脏患者中经常采用有氧运动或者抗阻运动方式，会更好地改善肾脏功能。NPT2a和NPT2c能够抑制肾脏磷的重吸收水平。本研究发现，运动组中NPT2a 和NPT2c mRNA 水平均有所下降，其中下坡跑组NPT2a mRNA表达水平显著下降。

Cyp24α1 在维生素D3 的代谢中起着核心作用，1，25（OH）2D3 在Cyp24α1 依赖性代谢中存在物种差异性，人类Cyp24α1 表现出由C-23 和C-24 羟基化途径，鼠系Cyp24α1 表现出C-24 相对C-23 途径的优势性。此外，维生素D 类似物也存在Cyp24α1 依赖性代谢的种属差异[21]。在哺乳动物细胞和大肠杆菌细胞中表达的Cyp27b1 突变体均未显示对1，25（OH）2D3 活性影响。另外Sawada等[22]指出，Cyp27b1突变位的氨基酸残基与Cyp24α1相同，Cyp24α1缺陷导致脑黄疸性黄瘤病（CTX），这是一种常染色体隐性脂质贮积病。在中医研究中，衰老大鼠肾上腺皮质Cyp27b1 表达下降，Cyp24α1 表达上升；在淫羊藿苷对衰老大鼠肾上腺皮质中Cyp24α1和Cyp27b1的药物干预下，淫羊藿苷不同剂量组大鼠肾上腺皮质Cyp27b1表达上升，Cyp24α1则相对下降[23]，表明衰老大鼠出现维生素D 失衡，反而需要提高1，25（OH）2D3 水平。通过对生长期小鼠的运动干预，本研究发现，跳跃组和下坡跑组Cyp24α1 mRNA 表达水平极显著高于对照组，下坡跑组Cyp27b1 mRNA 表达水平低于对照组。说明24-羟化酶表达水平升高，1α-羟化酶表达水平降低，共同减弱1，25（OH）2D3水平。

3.4 运动对血磷和1，25（OH）2D3的影响

骨矿物盐中的羟基磷灰石主要由钙和磷构成，由于骨重建是一个持续动态过程，磷可通过骨释放入血，引起血磷水平变化，对于肾脏功能不全的患者，会导致磷含量过高，其中高磷血症是CKD 最常见的并发症之一。而运动可有效改善血磷水平，在为期50周的耐力运动中，当摄入钙磷比为2∶1 时，运动可有效提高股骨湿重和股骨钙含量[24]。本研究在不改变饲养配料的基础上，发现长期运动干预会有效缓解血磷水平，尤其是在游泳运动和下坡跑运动中，血磷水平具有极显著性差异，显著低于对照组血磷水平。其中血磷浓度降低，与运动存在必然联系，随着骨骼质量提高，以及骨内分泌系统中FGF23 分泌增加，钙磷结构逐渐发生变化。而对于去卵巢的SD大鼠，不同强度运动下血磷没有显著性改变[25]。

维生素D3 的活性形式1，25（OH）2D3 在钙和磷稳态、免疫反应和细胞分化中起着重要作用，超过1000种维生素D 类似物用于I 型佝偻病、骨质疏松症、肾性骨营养不良、白血病和乳腺癌等[21]。本研究发现，伴随着血磷下降的还有血清1，25（OH）2D3 的含量下降。对老年人的高维生素D 摄入和运动干预下，Scott 等[26]也认为，受试者身体机能的提高主要是由于运动引起的效果。在健康男性中，维生素D 通过肝脏（25-羟化酶）形成25（OH）2D3 后，经过肾脏（1-羟化酶）转化为1，25（OH）2D3，其中1，25（OH）2D3 对于血钙稳态、骨代谢平衡和神经肌肉稳态具有重要作用，还具有抗恶性细胞增生、促进分化和免疫调节[27]。

4 结论

与跳跃运动和游泳运动相比，下坡跑运动能够显著提高生长期雄性小鼠的骨骼质量，增加股骨湿重，引起FGF23 表达水平升高，并通过FGF23--Klotho∕FGFR1 轴调节肾脏功能，降低NPT2a 和NPT2c 表达，降低血磷水平；提高Cyp24α1表达，降低Cyp27b1表达，降低1，25（OH）2D3水平。