重庆地区CYP2C9和VKORC1基因多态性与华法令药物敏感性的相关研究*

刘 玲，陈 敏，黄恒柳，何建维，杜金艳，唱 凯，皮 燕

(陆军军医大学大坪医院野战外科研究所：1.检验科；2.神经内科，重庆 400042)

华法令是目前临床广泛使用的香豆素类口服抗凝药物，主要应用于深静脉血栓、肺栓塞、心房颤动、左心室血栓等疾病的治疗[1]。路航等[2]对2014年房颤指南解读中提及，据GLORIATM-AF登记的全球性研究数据显示，中国患者华法令使用率最低，仅为20.3%，欧洲高达63.9%。大量国内外研究表明[3-6]，细胞色素P450超家族(CYP)中的CYP2C9，维生素K环氧化物还原酶复合体亚单位1(VKORC1)的基因多态性与华法令用药剂量的个体差异密切相关。

目前研究表明，华法令治疗窗窄，不同民族、个体间使用剂量存在明显差异[7]。临床上超剂量用药有出血风险，而华法令用药剂量不足将导致血栓形成。遗传因素是影响华法令用药的根本因素，而遗传因素中影响华法令剂量及代谢最主要的是VKORC1、CYP2C9基因多态性，可解释高达40%～60%华法令剂量个体差异[8-10]。本文就重庆地区人群CYP2C9和VKORC1基因多态性的分布进行研究，旨在为重庆地区华法令用药提供依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2017年2月至2018年12月陆军军医大学大坪医院检验科检测了CYP2C9和VKORC1基因多态性的患者657例，其中男357例，女300例，采用乙二胺四乙酸二钾抗凝管采集外周血2～3 mL。所有患者为无血缘关系的重庆汉族人。

1.2仪器与试剂 血液基因组DNA提取试剂盒(购自中国北京天根有限公司)；CYP2C9、VKORC1基因多态性检测试剂盒、生物芯片杂交仪、生物芯片识读仪均购自中国上海百傲有限公司；PCR仪购自美国Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1标本采集 乙二胺四乙酸二钾抗凝管采集患者外周血2～3 mL，充分混匀，及时送分子室检测。

1.3.2DNA提取 静脉血按照全血DNA提取试剂盒说明书操作提取DNA。DNA样品-20 ℃保存，反复冻融不超过3次。

1.3.3PCR扩增 取出提前分装好的CYP2C9和VKORC1扩增液，扩增反应体系25 μL：CYP2C9和VKORC1扩增液22 μL、反应液1 μL、DNA模板2 μL。扩增条件：94 ℃预变性10 min；94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 5 min终止反应。扩增产物于2～8 ℃保存。

1.3.4杂交显色 (1)杂交试剂准备：按照说明书配制杂交反应液、抗体使用液，加入试管架对应孔内。(2)CYP2C9和VKORC1基因芯片做好标记，放入杂交仪片架中。(3)杂交反应液中加入10 μL扩增产物，混匀，将试管架放入杂交仪，运行杂交程序。(4)取出芯片，放入生物芯片识读仪中，用百傲基因芯片图像分析软件进行图像扫描和数据分析，输出检测结果。

1.4统计学处理 用SPSS17.0统计软件进行统计分析。用频数计数法计算各基因型及等位基因频率，用χ2检验比较基因型多态性在不同性别及疾病人群间的差异，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1CYP2C9和VKORC1基因型检测 CYP2C9和VKORC1扩增产物经基因芯片分析后的基因型生物芯片识别图，见图1。

注：A表示*1/*1 AA；B表示*1/*1 GA；C表示*1/*3 AA
图1 CYP2C9和VKORC1基因芯片检测结果

2.2CYP2C9和VKORC1基因型频率及等位基因频率 本研究中*1/*1型594例(90.41%)，*1/*2型3例(0.46%)，CYP2C9*1/*3型60例(9.13%)，其中*1等位基因频率为95.21%，*2等位基因频率为0.23%，*3等位基因频率为4.56%。AA型542例(82.50%)，GA型112例(17.04%)，GG型3例(0.46%)，其中A等位基因频率为91.02%，G等位基因频率为8.98%。各基因型及等位基因分布在男女之间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.3不同基因型人群的华法令使用剂量 本研究中检测出8种基因型：*1/*1 AA型483例(73.52%)，*1/*1 GA型106例(16.13%)，*1/*1 GG型3例(0.46%)，*1/*2 AA型1例(0.15%)，*1/*2 GA型1例(0.15%)，*1/*3 AA型57例(8.68%)，*1/*3 GA型5例(0.76%)，*1/*3 GG型1例(0.15%)，未检测出*1/*2 GG型。各基因型分布比较，差异无统计学意义(P>0.05)。其中需要使用高剂量华法令(5.0～7.0 mg)占16.59%，中等剂量(3.0～4.0 mg)占74.73%，低剂量(0.5～2.0 mg)占8.68%。见表2。

表1 CYP2C9和VKORC1基因多态性分布(n)

表2 不同CYP2C9和VKORC1基因型人群的分布及FDA推荐华法令使用剂量[n(%)]

注：a表示华法令高度敏感型，使用剂量为0.5～2.0 mg；b表示华法令敏感型,使用剂量为3.0～4.0 mg；c表示华法令不敏感型，使用剂量为5.0～7.0 mg

2.4CYP2C9和VKORC1各基因型分布在不同疾病患者间的比较 本研究收集冠心病患者376例、房颤患者117例、支架术后患者28例、静脉血栓患者26例、其他心血管疾病患者93例、其他17例，其中冠心病患者最多。共检测出8种基因型，其中*1/*1 AA型最多。各基因型分布在不同疾病患者间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 不同疾病患者CYP2C9和VKORC1基因多态性比较(n)

3 讨 论

华法令是由R-和S-对映体组成的外消旋混合物，起抗凝作用的主要是S-华法令，有研究表明，S-华法令抗凝作用比R-华法令高3～5倍[11]。细胞色素CYP2C9是一类主要存在于肝脏、肠道中的单加氧酶，华法令在肝脏中经CYP2C9代谢为非活性产物。CYP2C9基因位于染色体10q24.2，全长约55 kb[12]。目前已发现多种突变等位基因，其中以CYP2C9*2和CYP2C9*3突变型最为常见。CYP2C9基因突变导致酶活性降低，机体对华法令代谢减缓，华法令在体内堆积，出血风险增加，因此CYP2C9基因突变者华法令剂量应减少。VKORC1为维生素K循环中1个关键酶，可抑制依赖维生素K凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ活性，华法令通过抑制VKORC1发挥抗凝作用。VKORC1基因位于染色体16p11.2，全长约11 kb[12]。VKORC1存在基因多态性，尤其是-1639G>A，VKORC1基因突变后会导致酶活性降低，对华法令敏感程度增强，出血风险增加，故VKORC1基因突变者华法令使用剂量也应减少。

本研究结果显示，重庆地区CYP2C9和VKORC1基因型以*1/*1型和AA型为主，频率分别为90.41%、82.50%，这与文献报道的中国汉族人群CYP2C9、VKORC1多态性一致[13]。CYP2C9基因突变在男女之间差异无统计学意义，这与文献报道不一致[14]。本研究结果显示，重庆地区使用高剂量华法令(5.0～7.0 mg)比例为16.59%，中等剂量(3.0～4.0 mg)比例为74.73%，低剂量(0.5～2.0 mg)比例为8.68%。随着分子生物学的发展，个体化用药已经成为了研究热点，CYP2C9、VKORC1基因检测开始受临床医生重视，但大多数医生使用华法令抗凝依旧采用经验剂量给药，对本该需要使用高剂量华法令抗凝患者使用普通剂量华法令，抗凝效果减弱，甚至有出血风险。对华法令低剂量基因型患者使用普通剂量华法令，则可能导致抗凝过度，甚至出现血栓。研究表明，与未进行基因检测患者相比，根据CYP2C9和VKORC1基因检测结果用药的患者出血及血栓发生风险降低29%，总住院率减少31%[15]。

4 结 论

重庆地区CYP2C9和VKORC1基因型以*1/*1 AA为主，人群以华法令敏感型为主，敏感型人群建议华法令起始剂量3.0～4.0 mg。华法令用药前建议进行CYP2C9和VKORC1基因检测从而提高华法令使用的安全性及有效性。