HPLC法同时测定复方炔雌醇甲羟孕酮胶囊中4种活性组分

杜 晖，任 静，范 菲，杨会鸽，郑 妍

0 引言

复方炔雌醇甲羟孕酮胶囊是由炔雌醇、醋酸甲羟孕酮、维生素D2、维生素E和淫羊藿浸膏等制成，可用于雌激素水平下降和妇女更年期综合征的对症治疗[1]。维生素D2和维生素E同属脂溶性维生素，多采用气相色谱法[2]和高效液相色谱法正向洗脱[3-4]测定。淫羊藿具有强筋骨、益精气和补肾壮阳之功效[5]；而淫羊藿苷是其中一种最重要的类黄酮类有效成分[6]，有抗肿瘤[7]、增强性腺功能[8]和延缓衰老等[9]药理学作用，多采用高效液相色谱法[10-11]和液质联用[12-13]控制其含量。该药品现行标准中采用2种色谱体系分别对其中醋酸甲羟孕酮和维生素E进行含量测定，缺少维生素D2和淫羊藿苷的质控指标。因此，建立一种能够同时分析多种有效组分的方法尤为重要。本研究采用液相色谱梯度洗脱法，50 min内快速分离测定复方炔雌醇甲羟孕酮胶囊中淫羊藿苷、醋酸甲羟孕酮、维生素D2和维生素E等4种组分，为药品质量标准的建立和完善提供依据。

1 仪器与试药

戴安U3000高效液相色谱仪，配有二极管阵列检测器(美国赛默飞世尔公司)；HC-3018R型低温冷冻高速离心机(合肥科大创新股份有限公司)；Milli-Q Advantage超纯水机(美国密理博公司)。

复方炔雌醇甲羟孕酮胶囊(复方制剂，由贵州神奇药业提供，批号：180401、180402、180403)；醋酸甲羟孕酮(批号：100001-201305，纯度99.6%)、维生素D2(批号：100155-201207，纯度99.0%)、维生素E(批号：100062-201811，纯度97.7%)和淫羊藿苷(批号：110737-201516，纯度94.2%)对照品购自中国食品药品检定研究院；甲醇为色谱纯(美国霍尼韦尔公司)；其他试剂为分析纯。

2 方法

2.1 溶液的制备

2.1.1 样品溶液的制备 取本品20粒，精密称定，计算平均装量。取内容物，混匀，研细，精密称取适量(约1粒内容物重)，置离心管中，精密加入甲醇25 ml，密塞，置水浴中超声提取15 min，3 000 r/min离心10 min，取上清液0.45 μm滤膜过滤即得。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取维生素D224.12 mg，置50 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液①；精密称取淫羊藿苷15.32 mg和醋酸甲羟孕酮33.40 mg，置50 ml量瓶中，精密加入对照品溶液①3 ml使溶解，再用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液②；精密称取维生素E 154.08 mg，置10 ml量瓶中，加对照品溶液②溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液③；分别精密量取对照品溶液③0.1、0.2、0.5、1、2、5 ml，置50 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2 色谱条件 色谱柱为Thermo C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相A为乙腈，B为甲醇，C为纯化水，具体比例如表1所示；柱温为25 ℃；流速为1.0 ml/min；进样量为10 μl；检测波长为260 nm。

表1 流动相比例(%)

3 结果

3.1 专属性考察 分别吸取空白溶剂、混合对照品和供试品溶液，按“2.2”项色谱条件进行液相分析，记录色谱图如图1所示，淫羊藿苷、醋酸甲羟孕酮、维生素D2和维生素E分别在6.1、17.7、35.4、40.3 min出峰，被分析物与干扰组分得到了有效的分离，分离度均大于1.5。

图1 试剂空白(A)、混合对照品(B)和供试品溶液(C，批号：180401)的色谱图

注：1.淫羊藿苷，2.醋酸甲羟孕酮，3.维生素D2，4.维生素E

3.2 线性范围和检测限的考察 精密量取“2.1.2”项所配置的淫羊藿苷、醋酸甲羟孕酮、维生素D2和维生素E的混合对照品溶液，按“2.2”项色谱条件进行液相分析，以峰面积Y(mAU·min)对样品浓度X(μg/ml)进行线性回归，相关系数均为1.000 0，如表2所示。当S/N约为3时，计算出4种组分的检测限分别为0.3、0.6、0.6、1.2 ng。

3.3 重复性及稳定性考察 将批号为180401的样品溶液连续进样6次，发现4种组分色谱峰面积的RSD值分别为0.56%、0.35%、1.05%、0.38%，证明该方法的重复性满足实验要求。将批号为180401的样品溶液保存在4 ℃环境中，并在24、48、72 h后进样分析，发现4种组分峰面积的RSD值分别为0.88%、1.25%、1.46%，样品在72 h内保持稳定。

3.4 回收率考察及样品测定 按“2.1.1”项方法对样品进行前处理，按“2.2”项色谱条件进行液相分析，测得3批复方炔雌醇甲羟孕酮胶囊中4种组分的含量。维生素D2的含量较标示量低，可能是在运输、存储的过程中发生了降解。

按“2.1.1”项方法向批号为180401的样品中准确加入高、中、低3种浓度的标准溶液，每组浓度平行3份，计算回收率。结果显示，平均回收率为96.8%～102.7%，相应的RSD为0.76%～2.43%。见表3、表4。

表2 四种组分的回归方程、相关系数、线性范围和检测限

注：*维生素E线性范围单位为mg/ml

表3 四种组分的回收率(n=9)

注：*维生素D2加入量和测得量的单位为μg

表4 样品测定结果

4 讨论

4.1 检测波长的考察 醋酸甲羟孕酮的最大吸收波长为240 nm，淫羊藿苷的最大吸收波长为270 nm，维生素D2和维生素E的最大吸收波长为265 nm和285 nm。考虑到维生素E的含量较高，为了兼顾到多组分的响应，我们将检定波长设置为260 nm，此波长下4种组分均有较高的吸光值。

4.2 提取溶剂的考察 笔者比较了相同的超声时间下，甲醇、甲醇-水(80∶20)和甲醇-水(50∶50)等3种溶剂的提取率和样品出峰情况。试验发现，甲醇-水(50∶50)提取，淫羊藿苷的提取率最高且峰形最好；但是维生素D2和维生素E属脂溶性物质，在含水介质中无法溶出，提取率较低；甲醇作为溶剂可以兼顾所有目标成分的提取，从而满足我们分析要求。

4.3 流动相的考察 由于淫羊藿苷和脂溶性维生素的极性差别较大，我们考虑采用一定比例的流动相梯度洗脱。由于初始状态流动相的极性强于溶剂，导致淫羊藿苷峰形前沿严重，所以改用乙腈-水洗脱，后者峰形好于甲醇体系样品；但是维生素E在乙腈体系中峰延展严重，故我们调整有机相比例，增大流动相中甲醇含量，25 min以后采用甲醇-乙腈(95∶5)洗脱，得到较为满意的结果。

5 结论

复方炔雌醇甲羟孕酮胶囊原有标准及相关文献中均无维生素D2和淫羊藿苷的含量测定，检验项目的合理性和全面性等方面存在较大缺陷。本文采用高效液相色谱法梯度洗脱对胶囊中4种组分进行了分离测定，将原本3个体系才能完成的分析任务大大简化，缩短了分析时间，为该药品安全有效的质控方法的建立提供了依据，结果亦能真正反映药品的内在质量。