二苯乙烯苷调控MAPKs信号通路诱导大肠癌SW116细胞凋亡

雷 锐，刘 艳

0 引言

大肠癌(Colorectal cancer)是常见的消化道恶性肿瘤，由美国癌症协会发布的临床调查数据显示，全球大肠癌的发病率及死亡率占恶性肿瘤的第5位，且每年新出现的患者例数在不断增加[1-2]。目前大肠癌治疗的手段以手术为主，化疗是重要的辅助治疗方案。然而临床发现大多数化疗药物效果不佳，毒副作用较多，术后患者生存率较低[3-4]。细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)、c-Jun 氨基末端激酶(JNK)、p38 MAPK是丝裂原活化蛋白激酶家族(MAPKs)的3个成员，介导肿瘤细胞的增殖、凋亡等多个生物过程[5]。MAPKs是连接细胞膜表面受体和基因表达的重要信号调节酶，已发现哺乳动物肠道组织细胞内至少存在4种MAPKs,即ERK、c-Jun氨基末端激酶(JNK1/JNK2)和p38 MAPK(α,β)和ERK5/BMK1，并且上述信号途径还参与大肠肿瘤细胞增殖、分化、侵袭及迁移等生物学过程[6]。二苯乙烯苷(2,3,5,4′-etrahydroxy stilbene-2-O-β-D-glucoside，THSG)主要来源于蓼科蓼族植物何首乌，属于一种具有天然生物活性的抗毒素，其在抗氧化、抗炎症方面发挥着重要的生物学作用[7-8]。此外，THSG在抗肿瘤方面也有较高的生物活性，包括通过调节PI3K/Akt信号通路抑制乳腺癌细胞增殖[9]；通过调节MAPKs信号通路抑制黑色素瘤细胞增殖[10]。本文以大肠癌SW116细胞为研究对象，探讨了THSG对SW116细胞增殖、凋亡及MAPKs信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 大肠癌SW116细胞购自ATCC；DMEM培养基购自Invitrogen公司；胰蛋白酶、胎牛血清购自Gibco公司；二苯乙烯苷购自上海宝曼生物科技有限公司，批号：6634-52-6；Western blot试剂购自武汉谷歌生物有限公司；CCK8试剂盒购自上海工程生物公司；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自江苏凯基生物有限公司，批号：KGA106；兔抗p38、ERK、JNK、p-p38、p-ERK、p-JNK、Pro-caspase 3、Cleaved-PARP和β-actin抗体购自英国Abcam公司；JNK特异性抑制剂(SP600125)、p38特异性抑制剂(SB203580)和ERK特异性抑制剂(U0126)购自美国Sigma公司。

1.2 SW116细胞培养 将冻存于液氮中的SW116细胞株进行复苏，待细胞贴壁饱和至适当密度后进行传代培养，具体操作如下：从培养箱中取出培养瓶至超净工作台，无菌PBS清洗2遍，加入适量浓度的胰蛋白酶消化至细胞变圆，然后加入新鲜培养液终止消化，将细胞吹散后转移至离心管中，1 000 r/min离心5 min，加入含10%胎牛血清的完全培养液吹散分装于2个培养瓶中，置于5% CO2、37 ℃恒温条件下培养。

1.3 CCK8实验检测细胞增殖 把生长良好的细胞消化、重悬、接种于96孔板中，每孔加入200 μl细胞混悬液，边缘孔用200 μl PBS填满后培养过夜。细胞贴壁后，加入含不同浓度THSG (0、5、10、20、40、80、120 mmol/L)的培养液处理SW116细胞24、48、72 h后，取出96孔板，弃上清，每孔加入20 μl CCK8溶液，孵育2 h后采用酶标仪检测450 nm处的吸光度OD值，并计算细胞活力。

1.4 流式细胞仪检测细胞周期 把生长良好的细胞消化、重悬、接种于6孔板中，每孔加入2 ml细胞混悬液培养24 h，加入含不同浓度THSG (0、10、20、40 mmol/L)的培养液处理SW116细胞24 h后，收集细胞，悬浮细胞直接转移至离心管，贴壁细胞胰酶消化后转移至离心管，再用PBS清洗细胞3次，5 000 r/min离心6 min，收集细胞；将细胞重悬后分别加入5 μl Annexin V和 PI避光染色，利用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

1.5 Western blot分析蛋白表达 把对数生长期细胞消化、重悬、接种于6孔板中，每孔加入2 ml细胞混悬液培养24 h，加入含不同浓度THSG (0、10、20、40 mmol/L)的培养液处理SW116细胞24 h后，收集细胞，加入裂解液冰上充分裂解30 min，经超声破碎后离心取上清，100 ℃煮沸5 min使蛋白充分变性。蛋白经SDS-PAGE胶分离后将其转移至NC膜上，5%脱脂牛奶室温封闭2 h。TBST洗膜2次后孵育一抗，4 ℃过夜。TBST洗膜3次，每次10 min，室温孵育二抗1.5 h；TBST洗膜3次，每次10 min，ECL发光液浸泡3 min后进行曝光。

1.6 特异性抑制剂实验 取对数期细胞接种于6孔板，待细胞贴壁生长至60%左右时，加入p38、JNK、ERK特异性抑制剂SB203580 (10 μmol/L)、SP600125 (5 μmol/L)和U0126 (8 μmol/L)单独干预细胞1 h，然后THSG (20 mmol/L)处理24 h，流式细胞仪检测细胞凋亡率，Western blot分析相关蛋白表达。

2 结果

2.1 THSG抑制SW116细胞增殖 CCK8实验发现THSG能明显抑制SW116细胞增殖，见图1。

图1 THSG对SW116细胞增殖的影响

由图1可见，THSG浓度在5～120 mmol/L范围内，能够明显抑制SW116细胞的增殖，其抑制作用呈现剂量依赖性。对于同一剂量的THSG而言，随着干预时间的延长，细胞的存活率降低，表现出时间依赖性。

2.2 THSG诱导SW116细胞凋亡 流式细胞仪检测SW116细胞凋亡情况，见图2。不同剂量(0、10、20、40 mmol/L)THSG处理SW116细胞24 h后，细胞凋亡率分别为2.6%±1.2%、7.9%±1.8%、29.4%±5.1%、47.4%±5.6%，各药物处理组与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。

图2 THSG对SW116细胞凋亡的影响

2.3 THSG对SW116细胞中凋亡相关蛋白Pro-caspase 3和Cleaved-PARP表达的影响 Western blot检测SW116细胞中凋亡相关蛋白Pro-caspase 3和Cleaved-PARP表达水平，见图3。发现THSG对SW116细胞中Cleaved-PARP蛋白表达有诱导作用，而对Pro-caspase 3蛋白表达有抑制作用，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4 THSG对SW116细胞中MAPKs信号通路的影响 THSG干预组与对照组比较，SW116细胞中p-ERK的相对表达水平显著降低，而p-p38和p-JNK的相对表达水平显著升高(P<0.05)，变化程度表现出浓度依赖性。见图4。

2.5 抑制剂改变THSG对MAPKs信号通路及细胞凋亡 分别采用p38、JNK和ERK的特异性抑制剂SB203580、SP600125和U0126单独干预SW116细胞1 h，之后THSG处理24 h。实验结果发现SB203580、SP600125可以减弱THSG对p38、JNK磷酸化的诱导作用，U0126则增强了THSG对ERK磷酸化的抑制作用，见图5。采用流式细胞仪对细胞凋亡率进行检测，发现各组药物干预细胞的凋亡率如下：对照组(3.4%±1.3%)、THSG组(30.7%±5.6%)、SB203580组(6.4%±1.8%)、SP600125组(4.6%±1.4%)、U0126组(37.6%±5.8%)、THSG+SB203580组(15.3%±4.2%)、THSG+SP600125组(18.7%±4.7%)、THSG+U0126组(46.9%±6.2%)，其中THSG组与THSG+抑制剂组相比差异有统计学意义(P<0.05)。

图3 THSG对SW116细胞中凋亡蛋白表达的影响

图4 THSG对SW116细胞MAPKs信号通路的影响

图5 特异性抑制剂对p38、JNK和ERK信号途径活化的影响

3 讨论

大肠癌在肿瘤致死亡数中所占比例较高，术后5年生存率为60%，若出现肿瘤细胞转移，患者5年生存率不到10%[11-12]。早期较多研究发现，中药具有多种药理作用，如联合化疗药物可增敏减毒、降低肿瘤的复发转移等，在大肠癌的治疗中也表现出较高的生物活性[13]。其中二苯乙烯苷(THSG)的药理活性主要表现在抗炎和抗氧化等方面，近年来亦有THSG抗肿瘤活性的研究[9-10]。

本文采用大肠癌SW116细胞为体外研究对象，考察了THSG对SW116细胞增殖凋亡的影响。CCK8实验发现，THSG在5～120 mmol/L范围内对SW116细胞的增殖活性均有抑制作用，在THSG浓度低于50 mmol/L时，细胞增殖抑制率低于50%，并且没有发现明显的萎缩等生长不良现象，因此，后续实验采用10、20、40 mmol/L的THSG处理细胞。CCK8实验结果发现，THSG呈时间和浓度依赖的方式抑制SW116细胞增殖；流式细胞仪分析SW116细胞的凋亡率发现，THSG处理SW116细胞后，大肠癌细胞的凋亡率均有不同程度的增加。PARP和caspase 3蛋白表达调控着细胞凋亡过程，在肿瘤细胞凋亡发生过程PARP的切割显著增强，而Pro-caspase 3的表达亦因切割而明显降低[14-15]。本实验结果也发现，THSG能显著诱导PARP切割，抑制Pro-caspase-3蛋白表达，促使SW116细胞凋亡发生。

ERK、JNK和p38 MAPK属于MAPKs家族的3个成员，介导着肿瘤细胞的增殖、凋亡及迁移等多个生物过程[5-6]。有关报道证实JNK和p38 信号通路激活能够导致细胞凋亡[16]，然而ERK信号传导活化可以诱导细胞增殖及分化，属于细胞存活的正向调节子[17]。然而，已有研究提出，THSG能够通过调节MAPKs信号通路抑制肿瘤细胞增殖[10]。使用p38、JNK和ERK的特异性抑制剂SB203580、SP600125和U0126抑制MAPKs信号通路活化，也可以证实p38、JNK和ERK信号传导途径参与肿瘤细胞凋亡过程。本研究发现，THSG干预SW116细胞后，细胞中ERK的磷酸化水平显著降低，而p38和JNK的磷酸化水平显著升高，而且ERK、p38和JNK磷酸化水平变化与THSG的用药剂量呈正相关。为了进一步证实MAPKs信号通路确实介导了THSG诱导大肠癌细胞的凋亡，本实验采用p38、JNK和ERK特异性抑制剂阻断MAPKs信号传导，流式细胞仪观察SW116细胞凋亡情况。结果发现，阻断p38、JNK磷酸化可以部分逆转THSG诱导大肠癌细胞凋亡；ERK特异性抑制剂能增强THSG诱导大肠癌细胞的凋亡。总之，THSG通过激活p38和JNK信号传导，抑制ERK信号途径，诱导大肠癌SW116细胞凋亡。