香叶木素通过抑制破骨细胞分化治疗早期骨关节炎的可行性研究

丁洪志，穆 培，许志兴，丁 欢，陆雄伟

0 引言

骨关节炎(Osteoarthritis，OA)是当今骨科最常见的慢性疾病之一，随着预期寿命的增加，骨关节炎的患病率和发病率均上升，最终导致患者的关节功能下降，生活质量下降，并带来医疗成本及社会成本的浪费。该病的发病机制较为复杂，目前相关研究显示，其病理改变涉及关节软骨、软骨下骨、滑膜组织以及关节周围肌腱韧带等，其中以关节软骨、软骨下骨最受关注[1-2]。影响OA发展的危险因素包括衰老、环境因素、关节发育不良和损伤、先天遗传改变等[3]。

OA治疗指南包括非药物治疗、药物治疗和手术方法[4]。对于早期OA，推荐的治疗方法是非药物治疗，如减肥、有氧运动、物理治疗等[5]。OA药物包括非甾体抗炎药(NSAIDs)、曲马多、对乙酰氨基酚和阿片类药物，可以缓解症状，但由于其预防疾病进展能力的报道有限，因此可能无法减少手术需求[6]。此外，目前还没有批准用于治疗OA的有效药物。

近10年研究显示，软骨下骨在OA中起着重要作用[7-11]。因此，破骨细胞作为骨吸收的主要细胞，最近成为治疗溶骨性疾病的新靶点[9,11-12]。

香叶木素(Diosmetin)是天然黄酮类化合物的一种，存在于菊花、留兰香、蜘蛛香等天然药物和柠檬、柑橘、花生等果实中，具有多重生物活性，如抗炎抑菌、抗氧化、抗肿瘤等，可以用来治疗肝、肺、肾、眼、神经系统疾病。近期相关报道已经证实其具有抑制破骨细胞分化功能[12]，然而，其在骨关节炎治疗方面的研究尚未见报道。

笔者首先在人体及小鼠体内验证骨关节炎软骨下骨改变与破骨细胞的相关性，然后通过细胞实验，验证香叶木素对于破骨细胞生成的抑制作用，进而提出合理推测，即香叶木素可以通过抑制软骨下骨中的破骨细胞活化，治疗早期骨关节炎，延缓骨关节炎发展。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 香叶木素(美国Selleck Chemicals中国分公司，纯度≥98%)；α-MEM培养基、胰蛋白酶及胎牛血清均购自美国Sigma-Aldrich公司；CCK-8试剂盒购自日本Dojindo Laboratories公司；巨噬细胞集落刺激因子(MSCF)与受体激活核因子(NF)κB配体(RANKL)均购自美国R & D Systems公司；逆转录及PCR试剂盒均购自TaKaRa中国分公司；所有引物均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 仪器 Infinite M200型多功能酶标仪(瑞士Tecan公司)；1300 SERIES A2型超净台(美国Thermo公司)；STERI-CYCLE型细胞培养箱(美国Thermo公司)；7500 Real Time PCR System(美国应用生物系统公司)。

1.3 细胞培养 通过骨髓冲洗从4周龄雄性C57BL/6小鼠中提取骨髓来源的单核巨噬细胞(BMM)，并在添加有10%FBS、1%青霉素/链霉素和30 ng/ml M-CSF的α-MEM培养基(称为完全α-MEM培养基)中培养5～7 d，待细胞长满至90%左右时用PBS清洗后加入胰酶消化，显微镜下观察，待细胞变圆后加入培养基终止消化，重悬后计数板计数细胞浓度。

1.4 细胞增殖检测 重悬液计数后以1×104个/孔接种于96孔板中，待24 h后细胞贴壁，更换含有不同浓度的香叶木素的完全α-MEM培养液，分别于1、3、5 d后吸去旧培养基，加入含有10% CCK-8试剂的培养基，孵育2 h后用酶标仪检测450 nm波长下OD值，实验重复3次。

1.5 人体及动物组织获取 从上海市第九人民医院(北部)骨科收集骨关节炎晚期行全膝关节置换患者的胫骨平台标本，共分析人体标本6个；从上海市第九人民医院动物房购买8周龄C57BL/6雄性小鼠共20只，分为ACLT(前交叉韧带切除)手术组(12只)与假手术组(8只)，术后1、2个月安乐死后取膝关节标本。组织标本多聚甲醛固定48 h后流水过夜，更换酒精保存，外送技术公司行组织病理切片及染色。显微镜下拍照，Image J软件计数，统计计数结果。

1.6 细胞TRAP染色检测分化情况 重悬液计数后以1×104个/孔接种于96孔板中，待24 h后细胞贴壁，吸去旧培养基，更换为含有100 ng/ml的RANKL及不同浓度的香叶木素的完全α-MEM培养液，隔日换液1次，培养至7～9 d，待BMMs融合后，PBS清洗2～3次，4%多聚甲醛固定20～30 min后使用TRAP染色试剂盒染色。显微镜下拍照，Image J软件计数，统计计数结果。

1.7 RT-PCR检测破骨细胞生成相关基因表达情况 重悬液计数后以30×104个/孔接种于6孔板中，待24 h后细胞贴壁，吸去旧培养基，更换为含有100 ng/ml的RANKL及不同浓度的香叶木素的完全α-MEM培养液，隔日换液1次，培养至破骨细胞生成后2 d。Trizol法提取RNA，离心收集各组BMMs细胞，用反转录试剂盒将RNA反转成cDNA。根据NCBI上提交TRAP、CTSK的cDNA序列设计引物。TRAP：上游引物F：5′-CCTCTTCCCAACTCGTGCAG-3′，下游引物R：5′-TGAATCCATCTTGGCGGTGG-3′；CTSK：上游引物F：5′-GCGGGATCGTTATGCCTACA-3′，下游引物R：5′-GACGGCTCTTTCTGCTGCTA-3′；GAPDH：上游引物F：5′-GGAGAGTGTTTCCTCGTCCC-3′，下游引物R：5′-ACTGTGCCGTTGAATTTGCC-3′，进行qRT-PCR，以GAPDH为内参。PCR的反应体系：SYBR 5 μl，上游引物F 0.2 μl，下游引物R 0.2 μl，ROXⅡ0.2 μl，cDNA 1.1 μl，ddH2O 3.3 μl；PCR的反应条件：预变性95 ℃ 5 min，变性95 ℃ 30 s，延伸60 ℃ 40 s (TRAP、CTSK、GAPDH)，40个循环，延伸时读取光密度(D)值。采用最大二阶导数法(2-△△Ct)对数据进行统计。△△Ct=(实验组目的基因Ct平均值-实验组内参基因Ct平均值)-(对照组目的基因Ct平均值-对照组内参基因Ct平均值)。

2 结果

2.1 骨关节炎患者患侧与健侧胫骨平台软骨下骨的破骨细胞数量存在差异 骨关节炎患者的膝关节组织染色(HE染色，翻红O-固绿染色)结果显示，两侧软骨的病变程度明显不同(图1、图2)。同时，两侧的软骨下骨的破骨细胞数量明显不同，如图1、图2所示，TRAP染色阳性的破骨细胞计数结果显示，患侧软骨下骨的破骨细胞数量少于健侧(P<0.05)。

2.2 小鼠骨关节炎模型中手术组软骨下骨中的破骨细胞数量明显增多，呈现骨质疏松表现 分别对ACLT术后1、2个月的小鼠膝关节组织进行TRAP染色，如图3所示。术后小鼠膝关节TRAP染色阳性破骨细胞计数结果如图3所示，术后1个月手术组软骨下骨破骨细胞数量明显多于假手术组(P<0.05)，这一差异在2个月后消失。另外，我们对小鼠膝关节软骨下骨的显微结构进行了micro CT扫描，分析了骨显微结构相关数据，结果如图4、图5所示，术后小鼠膝关节明显呈现骨质疏松表现，相对骨体积(%)、骨小梁数量(/mm)、骨密度(g/cc)、连接密度(1/mm3)明显减少(P<0.05)，骨小梁连接数(1/mm)明显增加(P<0.05)。

2.3 香叶木素的细胞毒性检测 通过CCK-8试剂盒检测香叶木素的细胞毒性，如图6所示。加入不同浓度香叶木素后，第1、3、5天分别检测OD值以反映细胞活性，结果显示，与对照组相比，20、40 μmol/L香叶木素组显示出明显的细胞毒性，其OD值在加入香叶木素后第1、3、5天明显降低(P<0.05)，而在第5天时，1.25 μmol/L香叶木素组细胞活性高于对照组(P<0.05)。

图1 人膝关节组织HE、TRAP、翻红O-固绿染色结果

图2 人膝关节组织OARSI评分、破骨细胞计数统计结果

图3 手术组与假手术组术后1、2个月膝关节组织TRAP染色结果及破骨细胞计数比较

2.4 香叶木素对破骨细胞形成的影响 如图7、图8所示，与正常对照组相比，浓度为5 μmol/L及以上的香叶木素处理组TRAP染色阳性的破骨细胞数量明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)。同时，与对照组比较，加入2.5 μmol/L及以上的香叶木素后，破骨细胞形成相关基因TRAP、CTSK表达水平明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。见图9。

图4 小鼠术后1个月膝关节显微CT扫描结果

图5 小鼠术后2个月膝关节显微CT扫描结果

图6 香叶木素刺激1、3、5 d后不同药物浓度组OD值检测结果

3 讨论

目前，OA的药物治疗可以减轻症状，但无法减少手术的需要[6]。大部分关节软骨和关节软骨下骨逐渐退化，在OA的发展过程中可能存在一些潜在的相互作用[13-14]。因此，通过抑制破骨细胞生成，有望减少软骨下骨的丢失，减少关节软骨的病变，发挥治疗骨关节炎的作用。香叶木素是天然黄酮类化合物的一种，在自然界中分布广泛，目前相关研究证实其具有抗炎抑菌、抗氧化、抗癌作用[15]。香叶木素是香叶木素苷即地奥思明(Diosmin)在人体内肠道菌群降解作用下去除糖苷键后的代谢产物之一，可被人体吸收并降解[16]。地奥思明作为黄酮类静脉活性药物，通过增加静脉张力，促进淋巴液回流，促进微循环，对痔疮以及静脉功能不全发挥治疗作用[17]。

研究表明，软骨下骨的变化也在OA的发病机制中起重要作用[18-19]。通常认为软骨下骨硬化与OA中的软骨退化密切相关[20-21]。然而，除了这种肥大性OA之外，还提出了另一种OA表型，即骨质疏松性OA，其特征在于软骨下骨密度显著降低和重塑增加[22-23]。据报道，软骨下骨重建和骨形态变化水平显著升高与骨质疏松症患者[24]和动物模型中卵巢切除术引起的骨质疏松症更严重的软骨退变有关[25-26]。软骨下骨的改变主要由破骨细胞及骨细胞的平衡决定，破骨细胞数量相对增多或者活化会导致软骨下骨的骨丢失，呈现骨质疏松表现。

图7 不同药物浓度组经MCSF 30 ng/ml+RANKL 100 ng/ml诱导7 d后破骨细胞TRAP染色结果

图8 不同药物浓度组经MCSF 30 ng/ml+RANKL 100 ng/ml诱导7 d后破骨细胞计数结果

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

图9 不同药物浓度组经MCSF 30 ng/ml+RANKL 100 ng/ml诱导9 d后TRAP、CTSK基因表达水平结果

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

首先，OA患者人体标本以及小鼠OA模型标本的组织染色中，显微CT扫描结果表明了破骨细胞与软骨下骨病变严重程度的相关性。在小鼠OA早期(术后1个月)的软骨下骨结构呈现骨质疏松表现(见图2)，尽管在术后2个月的小鼠软骨下骨CT分析中仍呈现骨质疏松表现，但是破骨细胞数量已经较假手术组没有明显差异。人体标本中证实，在OA晚期，软骨病变严重侧的软骨下骨破骨细胞数量明显少于健侧(图1A、图1B)；因此，我们推测OA早期的软骨下骨丢失与破骨细胞数量增多相关，而晚期的软骨下骨破骨细胞数量降低，并最终导致软骨下骨向早期骨关节炎相反的方向发展。因人体膝关节生理结构原因，膝关节内侧受力较外侧大，因此本研究中人体标本数据显示内侧为患侧，外侧为健侧。

软骨下骨是保证软骨完整的必要条件，任何单纯为了治疗软骨损伤而忽视软骨下骨完整性的治疗大多以失败告终[27]。因此，针对软骨下骨破骨细胞治疗OA的新途径逐渐得到关注。在细胞水平，香叶木素在未产生细胞毒性的浓度对破骨细胞生成具有抑制作用，基因水平检测也证实了其可以抑制破骨细胞形成相关基因(如TRAP、CTSK)的表达。香叶木素的细胞毒性实验证实，高浓度香叶木素对BMMs具有一定细胞毒性(图3A)，但是在尚未显示出细胞毒性的浓度，香叶木素就已经对破骨细胞生成产生抑制作用(图3A、图3D)。近期研究证实，香叶木素可以通过抑制MAPK信号通路活化，抑制破骨细胞生成[12]。

总之，本研究表明，破骨细胞的活化与OA早期软骨下骨改变相关，香叶木素能够抑制破骨细胞的生成，因此，香叶木素具有减少软骨下骨丢失的潜能，并有望通过抑制软骨下骨改变，治疗早期OA，延缓OA进程。