樱桃叶单宁的分布及累积特征

张超越，张茹涵，梁栋，李海刚，王守箐，刘林

（临沂大学药学院，山东临沂 276005）

单宁是由植物细胞合成的一类天然酚类化合物，产量仅次于纤维素、半纤维素和木质素[1]。单宁可分为水解性单宁和非水解性单宁，后者又称凝缩性单宁或原花青素[1-5]。水解性单宁是没食子酸与多元醇酯化产物及其衍生物，最常见的多元醇是β-D-葡萄糖[2-3]。非水解性单宁是黄酮类化合物的聚合物，最常见的单体是儿茶素和表儿茶素[4-5]。单宁溶于水，能吸收紫外线，与蛋白质反应，引起蛋白质结构和性质发生变化，从而破坏其正常功能，这一性质赋予单宁杀菌功能[6]。单宁与蛋白质作用的性质使草食性动物不愿取食那些积累大量单宁的植物，从而使植物免受这些动物伤害[7]。紫外线破坏蛋白质和DNA 等生物大分子的结构和功能，细胞通过积累单宁保护蛋白质和DNA 免受紫外辐射伤害[8-9]。因此，积累单宁是植物的一种自我保护机制[6-9]。研究表明，单宁具有抗氧化及抑制肿瘤等生物活性[10]。由于上述特性，单宁在食品、化妆品、医药、制革、造纸、冶金、水处理等许多领域得到应用。

了解植物叶器官单宁分布的特征，有助于分析其抵御病原菌侵染和紫外辐射伤害机制。樱桃是栽培面积较大的果树，但樱桃叶单宁积累的特征研究还鲜有报道。本研究采用组织化学和超微技术对樱桃叶单宁分布进行了显微和超微分析，了解了单宁积累及其分布特点，从而揭示樱桃单宁的紫外辐射和病原菌防御机制，同时拓宽对樱桃生物学的认识，为单宁资源研究增添信息，也为樱桃叶的开发利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 植物材料

供试樱桃（Cerasus pseudocerasus）品种为金红樱桃，栽种于临沂大学校园内，树龄6 年，常规管理，长势良好。

1.2 组织化学方法

四氧化锇检测法：单宁与四氧化锇作用产生棕色至黑色产物[11-13]，据此，从樱桃树上剪取叶片，将叶片组织用2.5%戊二醛溶液固定后在1%四氧化锇溶液中浸泡4 h，再后用酒精脱水脱色，包埋于树脂中，切片，厚度为1 μm，显微镜下观察单宁。

三氯化铁检测法：利用单宁与三氯化铁反应产生蓝绿色的性质[14-15]，从樱桃树上取叶片，将叶片组织固定后在三氯化铁溶液中浸泡12 h，然后用酒精脱水脱色，包埋于树脂中，切片，厚度1 μm，显微镜下观察单宁。

1.3 透射电子显微技术

从树上取下叶片，将小于1 mm2的组织小块用2.5%戊二醛溶液（用0.05 mol/L 磷酸缓冲液配制）固定12 h，再用1%四氧化锇溶液固定4 h，酒精脱水，丙酮置换酒精，之后用Epon-812 树脂包埋，切片，厚度为60 nm，醋酸铀和柠檬酸铅双染[13]，透射电镜下观察单宁。

2 结果与分析

2.1 樱桃叶片的显微特征

图1 显示了樱桃叶片的显微结构，由图可知，樱桃叶片由表皮、叶肉和叶脉三个基本部分组成。上表皮细胞比下表皮细胞大，因而上表皮细胞数目较下表皮少。叶肉分化为栅栏层和海绵层，栅栏层细胞排列紧密，细胞间隙极小，而海绵组织细胞排列疏松，细胞间隙大。大小不同的叶脉构成脉序，大叶脉由维管束及其与表皮间的薄壁组织构成，薄壁细胞与相邻的叶肉细胞不同，细胞较大，叶绿体少，常见簇状结晶体。维管束位于海绵组织，距叶片下表皮较近。维管束被一层排列紧密的叶肉细胞包围，这层细胞构成维管束鞘。木质部位于近上表皮侧，韧皮部位于近下表皮侧，韧皮部细胞较木质部细胞小。

图1 叶片显微结构Fig.1 Microstructure of leaf blade

2.2 樱桃幼叶单宁分布特征

图2（见下页）显示了樱桃幼叶单宁的分布特征，由图可知，幼叶叶片没有展开时，细胞排列紧密，没有细胞间隙，叶肉细胞尚未分化，没有栅栏组织和海绵组织之分。维管组织处于发育早期，还没有分化形成木质部和韧皮部（图2A）。

综合不同方法的检测结果，可以得出，单宁在幼叶中的积累有如下特点：第一，单宁不是在所有细胞中积累，而是只在部分细胞中积累（图2A-C），积累单宁的细胞与不积累单宁的细胞相邻，表明单宁不会从一个细胞向另一个细胞扩散，这是由单宁大分子特征及其与蛋白质作用的性质所决定的；第二，维管组织边缘细胞积累较多单宁，维管组织与表皮之间的细胞也积累较多单宁（图2A），表皮细胞积累较多单宁，将分化为叶肉的那些细胞积累较少单宁（图2B、C）。第三，单宁只在液泡中积累，被完全限制在液泡内（图2D、E）。

图2 幼叶中的单宁Fig.2 Tannin accumulation in young leaves

2.3 樱桃成熟叶片中单宁的分布

图3 显示了樱桃成熟叶片中单宁的分布，由图可知，叶片成熟时，叶肉组织分化成栅栏层和海绵层，前者排列紧密，后者排列疏松（图3A），维管组织分化出木质部和韧皮部（图3B）。成熟叶单宁积累有如下特点：第一，叶肉细胞，包括栅栏细胞、海绵细胞和围绕维管组织的叶肉细胞，即维管束鞘细胞积累较多单宁（图3A-D），相反，表皮（图3A、E）、维管组织（图3A、B、E、F）和维管组织与表皮之间的细胞（图3A）积累单宁明显较少；第二，各种组织中不是所有细胞都积累单宁，通常有少量细胞不积累单宁；第三，与幼叶一样，单宁在液泡中积累（图3A-F）。

图3 成熟叶中的单宁Fig.3 Tannin accumulation in mature leaves

3 讨论

植物单宁的产生和积累与环境因素有关，特别是紫外辐射。紫外线照射增加，单宁的积累也会增多[8-9]。单宁具有吸收紫外线的性质，植物细胞积累这种酚类化合物，吸收紫外线，从而保护细胞中的DNA 和蛋白质不受紫外线损伤[8-9]。此外，单宁还具有杀菌功能，细胞积累单宁能够防御病原菌入侵[6]。本研究表明，樱桃幼叶和成熟叶均积累单宁，单宁分布在各种类型细胞中，这样的积累和分布特征显示，樱桃叶具有以单宁为基础的紫外线和病原菌防御机制，保护叶细胞不受紫外辐射伤害，阻止病原菌入侵。除单宁外，樱桃叶还可能积累其他酚类化合物，即单宁不一定是樱桃叶唯一的紫外线和病原菌防御机制。

试验还发现幼叶表皮、维管组织以及维管组织与表皮间的细胞积累较多单宁，预定成为叶肉组织的细胞积累较少单宁；成熟叶的叶肉组织积累较多单宁，维管组织和表皮积累单宁较少，单宁的分布特征为樱桃叶片发育和行使功能提供了有效保护。维管组织细胞体积小、数量多，染色质含量高，对紫外辐射较为敏感，单宁积累形成紫外线防御机制，对维管组织保护具有重大意义。特别在维管组织发育早期，维管薄壁细胞还在发生分裂活动，分裂期的细胞对紫外辐射高度敏感，过度紫外辐射会使维管组织发育受到严重影响，从而进一步影响光合产物的韧皮部卸载，造成叶肉组织营养不良，最终影响叶片正常发育，因而在维管组织发育早期防御紫外辐射极为必要，幼叶维管组织外层细胞及维管组织与表皮之间的细胞积累大量单宁，为维管组织罩上吸收紫外辐射的单宁“帽”，有效地保护维管组织。幼叶中将分化为叶肉的细胞积累较少单宁，但是表皮积累较多单宁，为这些细胞提供了保护。成熟叶中，叶肉细胞负责光合作用，制造光合产物，维管组织负责将光合产物装载到韧皮部，运输到花、果实、茎尖、根尖等生长旺盛的部位，为细胞分裂、生长和分化提供物质基础，叶肉组织积累较多单宁，能够有效防御紫外辐射伤害，保证光合作用正常进行，同时给积累单宁较少的维管组织提供保护，保证光合产物正常运输。

很多酚类化合物具有很强的抗氧化活性、杀菌能力和抑制肿瘤的疗效[6-9]，这些特点决定酚类化合物具有多方面的应用。作为大分子酚类化合物，单宁不仅在制革业具有重要应用价值，在食品、医药等其他领域也有重要价值，如葡萄酒的抗氧化活性就来自于葡萄中的单宁。有研究表明，将富含单宁的柿叶加入饲料，可明显减少小鼠对饲料中脂类物质的吸收，降低体内的胆固醇、甘油酯和脂过氧化物的水平，减轻体重[10]。柿叶已被加工为茶，进入市场。电子显微镜下观察，樱桃叶与柿叶中的单宁具有非常相似的特征，因此樱桃叶具有潜在的开发价值。