miR-195在子宫内膜癌患者血浆和组织中的表达及临床意义

张玉虹 孙喜斌 李立楠 康燕华 石克威 马会 于治芳 陈江平

河北北方学院附属第一医院妇产科（河北张家口075000）

我国是子宫内膜癌的高发地区，关于子宫内膜癌发病机制及生物学行为特点的研究一直是肿瘤医学的热点［1］。根据中国癌症中心最新发布的数据显示，子宫内膜癌已成为我国发病率最高的女性生殖系统恶性肿瘤之一［2］，但是由于其病灶多局限于子宫体，生长和转移速度较慢，多数早期患者预后良好，5年生存率超过70%［3］。因此大力开展子宫内膜癌筛查工作，对于患者的早期确诊以及个体化治疗具有重要的临床价值。但是目前国内外对于子宫内膜癌的筛查方面尚未形成健全的筛查理念和成熟的筛查手段，在高危人群中进行选择性筛查更适合我国目前的国情［4］。除了肥胖、高血压、糖尿病、多囊卵巢综合症等高危因素［5］以外，从子宫内膜癌的发病机制出发寻找有效的生物标志分子也是医学工作者研究工作的重点。2004年，CALIN 等［6］首次证实一半以上的miRNA 位于染色体脆性位点，并且与众多已知的原癌基因和抑癌基因的表达密切相关。血清miRNAs 已成为新一代最有潜力的诊断和预后生物标志物之一。KONG 等［7］和李万斌等［8］都曾通过细胞学实验证实miR-195 可抑制子宫内膜癌细胞的增殖和转移，但是其作为子宫内膜癌诊断和预后生物标志物的潜力尚未见有学者关注。因此，本研究通过检测miR-195 在子宫内膜癌患者外周血和肿瘤组织中的表达水平，以及与临床病理参数和预后的相关性，旨在证实血清miR-195 成为子宫内膜癌早期诊断指标和预后判断分子的潜力。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2012年1月至2017年1月在河北北方学院附属第一医院行手术切除获取的子宫内膜癌以及相配对的癌旁组织标本120 例，术后经病理证实均为子宫内膜癌。子宫内膜癌组按照病理类型：内膜样腺癌61 例，浆液性癌34 例，透明细胞癌16 例，特殊病理类型9 例（黏液性腺癌4例、未分化癌3 例、鳞癌1 例、小细胞癌1 例）。同时采集所有患者术前外周血液样本。患者年龄35 ～67 岁，平均（51.25 ± 8.36）岁。纳入标准：所有患者均为原发灶，首次切除；术前未接受过放疗、化疗、内分泌治疗等相关抗肿瘤治疗；临床病理资料完整；肿瘤组织与癌旁组织距离≥3 cm；手术方式为子宫内膜癌分期手术（广泛子宫切除术、双附件切除及盆腔淋巴结清扫术）。排除其他妇科疾病、急慢性炎症、免疫系统疾病者。另随机选取同时期因子宫肌瘤在本院行手术切除，经术后病理证实是正常子宫内膜的患者术前血液样本60 例，患者年龄25 ～71 岁，平均（53.98 ± 9.44）岁；健康体检合格者60 例，患者年龄24 ～78 岁，平均（53.47±10.21）岁。子宫肌瘤患者的纳入标准：首次子宫手术，临床病理资料完整者。排除合并恶性肿瘤、急慢性炎症、免疫系统疾病者。两组患者的年龄比较差异无统计学意义（P＞0.05）。所有组织标本均在离体后30 min 内取得，经生理盐水清洗后迅速放入液氮中，2 d 内移至-80 ℃冰箱中保存。本项研究已获得河北北方学院附属第一医院伦理委员会的批准（伦理批号：20120118-02）。在采集患者血液样本或病理组织标本前以书面形式告知受试对象或家属研究的目的及风险，并由患者或家属签署书面知情同意书。

1.2 血浆和组织样本总RNA提取及实时荧光定量PCREDTA 抗凝管采集外周血4 mL，3 500 r/min离心10 min 至冻存管，-80 ℃保存备用。取血液样本采用miRNeasy Serum/Plasma Kit（大连TAKARA）提取血浆总RNA。另取组织标本100 mg，采用TRIzol 试剂（美国SIGMA）提取组织总RNA。采用紫外分光光度计检测RNA 浓度（OD260nm/OD280nm在1.8 ～2.1 之间则提取的RNA 合格）。取2 μL RNA为模板，根据SuperScript RT kit（大连TAKARA）说明书操作逆转录合成cDNA。取50 μg cDNA 为模板，按照miScript SYBR Green PCR master Mix（大连TAKARA）说明书进行PCR。冰浴中配制20 μL PCR 反应体系，PCR 扩增参数设置如下：95 ℃预变性10 min，36个循环（95 ℃变性15 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s），生成溶解曲线并分析。miR-195引 物 序 列（F：5′-GTATTCGCACTGGATACGACCGACC-3′，R：5′-TGCGCTAACAGTCTACAGCCA-3′）；内参小分子U6 引物序列（F：5′-CAGCAAACC AACAATGCCGA-3′；R：5′-GATCTGCGACCACAC CATGA-3′）。以2-ΔΔCt表示miR-195 相对表达量。

1.3 统计学方法IBM SPSS Statistics 17.0 软件和Graphpad Prism6 软件用于资料处理，miR-195 在血浆和组织中的表达量符合正态分布，以均数±标准差表示；子宫内膜癌患者血浆和子宫肌瘤患者血浆miR-195 表达量以独立样本t检验；癌组织和癌旁组织miR-195 表达量的差异采用配对样本t检验。绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线，并计算血浆miR-195 诊断子宫内膜癌的曲线下面积（area under curve，AUC）。子宫内膜患者血浆和取子宫内膜癌患者血浆或癌组织miR-195 表达的中位数，＞中位数则为高表达，≤中位数则为低表达。血浆miR-195 表达与患者病理参数的关系采用χ2检验。术后无复发生存分析用Kaplan-Meier 法并行Log-rank 检验。采用Cox 比例风险回归模型分析子宫内膜癌患者总生存期的危险因素。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 子宫内膜患者癌组织和癌旁组织miR-195 表达量比较癌组织中miR-195 表达量为（0.871 ±0.141），低于癌旁组织，差异有统计学意义（t=8.996，P＜0.05）。子宫内膜癌组织中miR-195 中位表达值为0.886（图1）。

图1 qRT-PCR 法检测miR-195 在子宫内膜癌组织和相配对的癌旁组织中的表达差异Fig.1 Difference of miR-195 expression in endometrial carcinoma tissues and adjacent tumor tissues

2.2 子宫内膜患者、子宫肌瘤患者和健康者血浆miR-195 表达量比较子宫内膜癌患者血浆miR-195表达量为（0.689±0.247），低于子宫肌瘤患者和健康者，差异有统计学意义（F= 8.996，P＜0.05）。子宫内膜癌患者血浆中miR-195 中位表达值为0.715（图2）。

图2 qRT-PCR 法检测miR-195 在子宫内膜癌患者、子宫肌瘤患者和健康者中的表达差异Fig.2 Difference of plasma miR-195 expression in endometrial carcinoma patients，hysteromyoma patients and healthy volunteers

2.3 ROC 曲线分析血浆miR-195 对子宫内膜癌的诊断价值经ROC 曲线分析，血浆miR-195 表达量对子宫内膜癌诊断的AUC 为0.732（95%CI：0.611 ～0.853），敏感度和特异度分别为71.5%和69.0%，约登指数为0.405。见图3。

图3 血浆miR-195 表达对诊断子宫内膜癌的ROC 曲线图Fig.3 ROC curve analysis of the diagnostic potential of plasma miR-195 expression on endometrial carcinoma

2.4 子宫内膜癌组织和血浆中miR-195 表达与临床病理特征的关系根据miR-195 在子宫内膜癌组织和血浆中miR-195 的中位表达量，60 例患者呈高表达，60 例患者呈低表达。组织miR-195 表达量与肿瘤分化程度、FIGO 分期、发病类型、浸润深度有关（P＜0.05），但是与年龄、淋巴结转移和病灶形态无关（P＞0.05）。血浆miR-195 表达量与FIGO 分期、发病类型、浸润深度有关（P＜0.05），但是与年龄、分化程度、淋巴结转移和病灶形态无关（P＞0.05）。见表1。

2.5 子宫内膜癌组织和血浆中miR-195 表达与预后的关系对120 例患者进行随访19 ～87 个月，平均生存时间为57 个月，29 例患者死亡，病死率为22.5%。绘制Kaplan-Meier 生存曲线，组织miR-195 高表达亚组死亡7 例，低于miR-195 低表达者（Log-rank χ2= 6.964，P= 0.008）。血浆miR-195 高表达亚组死亡9 例，低于miR-195 低表达者，有统计学差异（Log-rank χ2= 3.195，P= 0.047）。见图4。

2.6 单因素和多因素COX 风险回归分析子宫内膜癌患者生存期的影响因素以患者术后死亡作为因变量（死亡赋值为1，生存赋值为0），经单因素和多因素COX 风险回归模型分析，FIGO 分期、发病类型、浸润深度、淋巴结转移、血浆和组织miR-195 表达量与子宫内膜癌患者总生存期相关，是影响子宫内膜癌患者术后生存的独立预测因素（P＜0.05）。见表2。

表1 子宫内膜癌组织和血浆中miR-195 表达与临床病理特征的关系Tab.1 Correlation between expression of miR-195 expression and clinicopathological parameters

图4 子宫内膜癌患者随访期间Kaplan-Meier 生存曲线Fig.4 Kaplan-Meier survival curve of endometrial carcinoma patients during followed up

3 讨论

最新流行病学数据显示，子宫内膜癌已经成为我国发病率最高的女性生殖道恶性肿瘤，并呈年轻化趋势，一方面与环境、饮食、社会压力等因素有关，另一方面是因为我国近些年对子宫内膜癌筛查工作的重视以及诊断技术不断更新。但是由于筛查技术尚不成熟，而且缺乏大规模研究证实普遍筛查的经济学效益，因此，对于子宫内膜癌的筛查理念尚未形成国际统一的标准［9］。考虑到我国的基本国情，更倾向于对高危因素人群进行选择性筛查，例如子宫内膜癌“三联征”-肥胖、糖尿病、高血压患者。MATSUO 等［10］、石娅娅等［11］都曾进行Meta 分析，证实胰岛素抵抗可导致子宫内膜增生，是引发子宫内膜癌的重要病理基础，因此胰岛素抵抗、代谢异常、合并卵巢综合征等都是引发子宫内膜癌的高危因素之一。此外，根据2015年美国癌症协会指南推荐，对于高龄、无抵抗雌激素治疗、不孕不育等患者建议在专业医师指导下进行子宫内膜癌细胞学检查［12］。但是仅依靠高危因素作为选择性筛查的判断标准具有极大的主观性，寻找重复性高，对筛查、诊断、治疗和预后有指导意义的分子生物学标志物成为近年的探究热点。但是由于子宫内膜癌的发生机制复杂且尚不明确，为分子标志物的寻找带来了一定的困难。

表2 影响子宫内膜癌患者总生存期的单因素和多因素COX 风险回归模型分析Tab.2 Univariate and multivarable COX regression analyses of actors predictive of poor overall survival in endometrial carcinoma patients

MiRNAs 与肿瘤的关系毋庸置疑，而且众多研究已证实血miRNAs 是目前肿瘤诊断和预后方面最有潜力、且最有望用于临床的生物学标志分子。TSUKAMOTO 等［13］通过高通量miRNAs 芯片技术，筛选出在子宫内膜癌患者血液和组织中呈差异性表达的miRNAs 谱，其中miR-195 表达明显降低。此外，ZHENG 等［14］、LI 等［15］学者也证实miR-195 在非小细胞肺癌、膀胱癌等发生、发展过程中属于抑癌基因，表达量下调。但是miR-195 在子宫内膜癌中是否也属于功能性基因尚未见有研究证实。

本研究基于我院前期建立的长期随访数据库，选择了符合纳入标准的120 例子宫内膜癌患者的组织标本和血液样本，并在研究前确定了患者或家属的入组意愿。经检测，笔者发现miR-195在子宫内膜癌组织中的表达量明显低于癌旁组织。另外，为了进行对照性研究，笔者还采集了因子宫肌瘤在本院行全子宫切除术，经术后病理证实是正常子宫内膜的患者术前血液样本60 例以及健康体格检查正常的志愿者血液样本60 例，与子宫内膜癌患者的血液样本同时进行对比研究。结果显示，血浆miR-195 在子宫内膜癌患者中的表达量明显较子宫内膜正常的两组对照组血液样本降低，并且经ROC 分析，血浆miR-195 可用于子宫内膜癌的诊断。

在此基础上，笔者进一步结合子宫内膜癌患者的临床病理资料来分析miR-195 表达与肿瘤发生、发展的关系。结果显示组织miR-195 表达量与肿瘤分化程度、FIGO 分期、发病类型、浸润深度有关，而血浆miR-195 表达量与FIGO 分期、发病类型、浸润深度有关。20 世纪80年代，Bokhman 首次将子宫内膜癌分为Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型为雌激素依赖性低级别子宫内膜癌，Ⅱ型为非子宫内膜样癌（主要包括浆液性癌和透明细胞癌），与雌激素无关［16］。在本研究中，组织miR-195 在Ⅰ型患者中的表达量相对较Ⅱ型患者高，说明miR-195 可能与雌激素调节或者雌激素受体的表达有关，具体的作用机制需要进一步细胞学实验进行证实。但是血浆miR-195 未发现与患者发病类型有关，说明组织和血浆miRNAs 的表达谱可能存在一定的差异性。相较于血浆miRNAs，组织miRNAs 与患者病理特征的关系更明显，但是由于取材困难，用于临床检测有一定的困难，而血液样本取材方便，操作简便，miRNAs 表达稳定性良好，更适合用于临床检验［17］。而且笔者通过COX 风险比例回归模型分析，组织miR-195 和血浆miR-195 都是影响子宫内膜癌术后生存的独立因素。

综上所述，miR-195 在子宫内膜癌患者血浆中的表达量较子宫内膜结构和功能正常者明显下调，且在癌组织中的表达量也明显低于癌旁组织，可见miR-195 在子宫内膜癌的发生、发展过程中具有类似抑癌基因的活性。而且在各种病理参数和预后研究中，血浆miR-195 与患者FIGO 分期、发病类型、浸润深度、术后生存期均密切相关，因此血浆miR-195 有望成为子宫内膜癌辅助诊断和预后的敏感分子标志物，但是若应用于临床，尚需更大样本的数据分析。另外，目前关于miRNAs 在子宫内膜癌发生、发展中的作用机制尚不明确，也是阻碍miRNAs 成为新的生物学诊断分子的关键问题之一，因此更深入的研究miR-195 对子宫内膜癌细胞恶性生物学行为的调控作用和分子机制是下一步的工作重点之一。