小鼠脑代谢物活体磁共振波谱分析及与离体样本磁共振波谱与质谱定量分析的比较研究

陈炜　雷和花　宋涛　张利民　雷皓

摘 要 以水为内标的活体质子磁共振波谱（1H MRS）可非侵入性、原位、同时、定量分析多种脑代谢物的浓度，在临床神经/精神疾病诊断、疗效评估及相关基础研究中得到广泛应用。为验证以水为内标的活体1H MRS定量分析的准确性，本研究采集了小鼠纹状体和内侧前额叶脑区的活体1H MRS，测定了N 乙酰基天冬氨酸（NAA）、谷氨酸（Glu）、牛磺酸（Tau）、谷氨酰胺（Gln）和谷胱甘肽（GSH）这5种代谢物的绝对浓度;随后采集对应脑区的组织样本，经萃取后用液体核磁共振波谱（1H NMR）和超高效液相色谱 串联质谱联用（UHPLC MS/MS）法定量分析上述代谢物。经统计比较发现：3种方法所测得的NAA、Glu和Tau的绝对浓度无显著差异，且与文献报道一致，提示活体1H MRS定量分析具有与离体分析基本一致的准确性。活体1H MRS和脑组织萃取样本1H NMR定量分析所得的Gln和GSH的绝对浓度无显著差异。UHPLC MS/MS测得的Gln和GSH浓度与磁共振方法所得的结果显著不同，这可能是在样品前处理、离子化或定量过程中引入了系统误差所致。本研究初步验证了联合运用活体1H MRS和离体磁共振/质谱方法对同一脑区中多种代谢物进行同步定量分析的可行性。

关键词 质子磁共振波谱; 活体分析; 超高效液相色谱 串联质谱; 绝对定量; 内标准

1 引 言

神经化学物质是大脑对机体生理活动进行精准调控的物质基础[1]。神经/精神疾病的发生与发展一般都伴随有神经化学物质的代谢紊乱[2，3]。活体、原位、定量分析神经化学物质（或脑代谢物）的浓度并动态监测其变化轨迹，对于神经/精神疾病研究、诊断和疗效评估具有重要的意义。活体（In vivo）质子磁共振波谱（1H MRS）是现有的为数不多的可无创定量检测区域性脑代谢物浓度的方法之一，已被广泛应用于神经/精神疾病（如帕金森氏综合征，PD）的临床诊断和基础研究中[4，5]。利用活体1H MRS技术测得的脑代谢物的浓度也被证实与其所在脑区的结构、功能或病理状态有关[6]。

由于总肌酸（Total creatine， tCr）在正常生理状态下一般波动较小，活体1H MRS一般都选用其作为内标进行定量分析[7]。但在某些病理状态下， tCr的绝对浓度也会出现显著变化[8，9]，从而影响定量分析结果。也有研究者采用水的信号为内标进行定量分析[10～12]。但这种方法也存在一些潜在的问题。 首先，脑组织中水的含量和弛豫时间（Relaxation time）在不同个体、不同发育阶段及不同脑区都可能存在差异[13～15]，从而给绝对定量分析带来误差; 其次，脑代谢物的弛豫时间各不相同，且显著不同于水的弛豫时间，这在比较不同代谢物浓度时可能引入系统误差[16]。

为验证以水为内标的活体1H MRS定量分析的准确性和可信度，本研究测定了12月龄DJ 1基因敲除小鼠2个脑区中5种代谢物的绝对浓度，并与对应脑组织萃取样本的液体1H NMR和超高效液相色谱 串联质谱联用（UHPLC MS/MS）方法的定量分析结果进行了对比。液体1H NMR用外加已知浓度的3 三甲基硅烷基 2，2，3，3 氘代丙酸钠（TSP）作为内标，UHPLC MS/MS的定量分析采用外标法，即配制一系列浓度梯度的标准溶液，建立代谢物质谱信号响应值与绝对浓度之间的标准曲线。通过比较不同方法定量分析结果的异同，验证了联合使用活体1H MRS和离体方法对同一脑区中多种代谢物进行同步定量分析的可行性。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Bruker 7 T/20 cm Biospec成像儀与AVANCE Ⅲ 500核磁波谱仪（德国Bruker公司）; Agilent 1290型超高效液相色谱仪串联Agilent 6460型三重四级杆质谱仪（美国 Agilent公司）; ME204/02型电子分析天平、pH计 FE28型（瑞士Mettler Toledo公司）; 组织破碎仪（德国Qiagen公司）; 低温离心机（德国Eppendorf公司）; Speed Vac 真空离心浓缩仪（美国Thermo公司）。

色谱纯CH3CN、HCOOH、CH3OH、NAA、Glu、Gln、GSH、Tau及重水（D2O，99.9%氘代，含0.05% TSP）均购于Sigma Aldrich公司。实验用水为超纯水（电阻率大于18.2 MΩ·cm， 由德国Merck公司 Millipore Elix Advantage 系统制备）。分析纯NaCl、KCl、KH2PO4和Na2HPO4·12H2O均购于上海国药集团化学试剂公司。

2.2 实验动物

DJ 1基因敲除小鼠8只（由北京大学动物中心提供的种鼠繁育），体重（25.0±2.1） g，置于普通小鼠笼内，每笼2～3只，在SPF级动物房中饲养至12月龄。所有动物实验操作均遵从中国科学院武汉物理与数学研究所的实验动物伦理规范。采集活体1H MRS时，小鼠用1.0%～1.5%的异氟烷 氧气混合气体麻醉，体温维持在（37SymbolqB@1）℃。活体1H MRS实验完成后，立即断头，剥离大脑，放入液氮中冷冻30 s; 然后切取内侧前额叶（mPFC）和纹状体（Striatum）脑区组织，置于80℃保存。整个取样过程在3 min内完成。提取的脑组织被均分为2份，分别用于液体1H NMR和UHPLC MS/MS实验。

2.3 活体1H MRS实验

采用Bruker 7 T/20 cm Biospec动物磁共振成像仪，直径为72 mm的射频发射体线圈，单通道正交表面接收线圈。使用弛豫增强快速采集（RARE）序列采集定位像。实验参数如下：重复时间（TR）2500 ms， 回波时间（TE）36 ms，回波链长（RARE factor）4，视野（FOV）20 mm×20 mm，矩阵大小128×128，片厚0.5 mm，片数20，重复次数4。活体1H MRS采用单体元谱（PRESS）序列。实验参数如下：TR 4000 ms，TE 15 ms，谱宽4000 Hz，采样点数2048，带宽为4000/3000 Hz的Hermit激发/重聚脉冲，激发频率中心偏离水的共振频率

709 Hz。散相梯度场强度为25 mT/m，持续时间1.5 ms，所对应的扩散加权值为0.0178 s/mm2。 采用带宽为13500 Hz的90°双曲正割（Sech）射频脉冲进行体素外信号抑制。匀场后体素内水信号的半高宽（FWHM）低于10 Hz。每个脑区先采集一个重复次数为1的未压水的谱，然后采集一个重复次数为512的压水后的谱。压水采用弛豫优化的变间隔射频脉冲技术[17]。

2.4 脑组织萃取样本的1H NMR实验

每只动物取约3 mg的 mPFC组织和5 mg的纹状体组织。加入0.6 mL甲醇 水（2∶1， V/V），经组织破碎仪（20 Hz，90 s）和冰浴超声（超声1 min，停1 min，重复3次）破碎处理; 离心10 min（4℃，12000 r/min），收集上清液; 重复上述步骤2次并合并上清液。上清液用真空离心浓缩仪除去甲醇，冷冻干燥机除去水分。在所得的冻干粉中加入600 μL磷酸盐重水缓冲液（0.1 mol/L，pH=7.4，0.001% （w/V） TSP，>95% D2O），4℃下12000 r/min离心10 min，取500 μL上清液置于核磁管中。

液体1H NMR分析在配有超低温BBO探头的Bruker AV Ⅲ 500 MHz核磁共振波谱仪上进行，采样脉冲序列为ZGPR。弛豫等待时间（RD）和压水预饱和脉冲时间分别为17和2 s，采样谱宽20 ppm，采样时间4 s，累加次数128。样品温度保持在298 K。采用1H 13C HSQC二维谱进行质子信号归属。F2维（1H）与F1维（13C）分别采集2048与200个数据点。累加400次，F2维谱宽12 ppm，F1维谱宽175 ppm，压水预饱和脉冲时间1.5 s，garp组合脉冲去耦。

2.5 UHPLC MS/MS实验

每只动物取5 mg左右的mPFC与纹状体组织，加入0.4 mL冷甲醇（20℃冷冻12 h）、50 μL乙腈 水（1∶1，V/V，含0.1% 甲酸）及10 μL内标溶液（氘代乙酰胆碱）后，在组织破碎仪上破碎匀浆（20 Hz，90 s）。于20℃静止30 min后，在4℃以10000 r/min离心10 min，取上清液离心浓缩挥干。所得粉末加入100 μL乙腈 水（1∶1， V/V），经尼龙66针式过滤头（φ 13 mm，0.22 μL）过滤至色谱样品瓶。

色谱 质谱分析采用Agilent 1290型超高效液相色谱仪串联Agilent 6460型三重四极杆质谱仪。色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH Amide column（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）。柱温40℃，流速0.5 mL/min， 进样量1 μL。流动相A为乙腈 水（1∶1， V/V）; 流动相B为乙腈 水（90∶10， V/V）; 流动相A和B均含0.1%甲酸和10 mmol/L甲酸铵。采用线性洗脱梯度：  0 min，100% B; 第5 min開始，逐渐切换为 100% A，平衡时间为3 min。质谱仪离子源鞘气与干燥气温度均为350℃，流量均为10 L/min。 正离子检测模式，毛细管电压4000 V，喷嘴电压500 V。标准曲线法进行定量分析，即用5种目标代谢物的标准品配制一系列浓度梯度的混合溶液，在优化后的质谱条件下做标准曲线。

2.6 数据处理与统计

活体1H MRS数据采用LCModel 6.3 1A软件[18]（Stephen Provencher Inc.，奥克维尔，加拿大）处理。经相位、基线及涡流矫正等预处理后，采用分峰拟合的方法对各代谢物进行定量分析。未被压制的水的信号作为内标，其绝对浓度设为43300 mmol/kg。当代谢物的拟合不确定性（Cramer Rao lower bounds，CRLB）低于20%时，所得到的数据才被认为可靠并被用于最后的分析。液体1H NMR数据采用Bruker谱仪自带的TopSpin 3.6.1软件处理。原始信号先乘以线宽因子为0.3 Hz的指数窗函数后进行傅里叶变换。用TSP信号（δ=0.00 ppm）定标化学位移、手动基线及相位矫正。根据积分面积计算代谢物浓度。质谱数据用 Mass Hunter Qualitative software和 Mass Hunter Quantitative software（Agilent， B.06.00）软件处理。本研究中代谢物浓度均为平均值±标准偏差。Kolmogorov Smirnov检验用于确认浓度数据分布的正态性。统计比较采用以分析方法和脑区作为独立变量的双因素方差分析（Two way ANOVA）。Sidak事后检验评价不同分析方法所得的代谢物浓度的差异。

4 結 论

本研究利用以水为内标的活体1H MRS定量测量了12月龄DJ 1基因敲除小鼠纹状体和mPFC这两个脑区中5种代谢物的绝对浓度，并将活体分析的结果与对应脑组织萃取样本的1H NMR和UHPLC MS/MS定量分析的结果进行了对比。实验结果验证了以水为内标的活体1H MRS定量分析的准确性，同时也初步验证了联合使用活体和离体方法对动物脑区进行代谢物表型的可行性。

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