良恶性肺结节影像组学特征与分子标记物相关性研究

康书朝，丁忠祥，崔 凤，冯 琪，王 玫，牛家玲，王罗羽

(1.杭州市中医院 放射科，浙江 杭州 310007； 2.浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院 放射科， 浙江 杭州 310006)

肿瘤的分子生物学行为决定了病灶的病理形态学特征，同时也是不同影像学特征的基础。基因突变及相关蛋白表达与影像学特征关联性的研究将影像学研究范围拓展到微观的分子领域[1-2]。随着分子靶向治疗的深入研究，尤其是针对表皮生长因子(epidermal growth factor receptor, EGFR)突变的酪氨酸激酶抑制剂的出现，肺癌中EGFR突变阳性患者的总生存期超过2年[3]。EGFR是酪氨酸激酶活性的细胞膜受体，主要与肿瘤细胞的增殖、迁移、血管生成、抑制凋亡及药物抵抗有关[4]。EGFR敏感突变被确定为预测EGFR疗效最可靠的生物标志[5]。Ki-67抗原与肿瘤关系的研究表明[6]，Ki-67在肿瘤组织中含量越多，肿瘤细胞增殖越活跃，Ki-67与肿瘤的发生发展、分期、分级、复发及预后显著相关。Ki-67在多种实体恶性肿瘤中的表达远高于正常组织，能反映恶性肿瘤的增殖活性[7]。本研究旨在探索EGFR突变和Ki-67蛋白在肺腺癌中的表达情况及其与影像组学定量特征之间的相关性。

1 资料和方法

1.1 一般资料 采用回顾性方法收集杭州市中医院2013年6月—2018年6月经病理证实的肺结节患者120例。所有患者均经病理证实分别为肉芽肿性病变、肺原位癌、微浸润性肺腺癌和浸润性肺腺癌，每组各30例。肉芽肿性病变组为良性肺结节，男12例，女18例；年龄42～85岁，平均68.0±13.5岁。肺原位癌组、微浸润性肺腺癌组和浸润性肺腺癌组为恶性肺结节，肺原位癌男17例，女13例；年龄45～81岁，平均70.0±15.1岁。微浸润性肺腺癌男18例，女12例；年龄45～81岁，平均74.3±11.0岁。浸润性肺腺癌男16例，女14例；年龄45～88岁，平均72.3 ± 15.3岁。所选患者均有完整的EGFR基因、Ki-67蛋白统计资料。本研究经医院伦理委员会批准，所选患者均签署知情同意书。

1.2 肺CT检查方法 均采用Philips 256i CT(飞利浦公司)进行肺部CT扫描，采用肺部扫描模式，范围从肺尖到肺底，层厚5 mm，层间距5 mm，重建层厚1.5 mm，螺距1.0，矩阵512×512，管电压120 kV，自动毫安秒技术，迭代算法图像重建，视野(FOV)330 mm，肺窗窗宽1500，窗位-400。

1.3 肺CT影像组学定量特征 采用ITK-SNAP软件进行图像分割。选取层厚为1.5 mm的肺部CT图像，在包含选定肺结节的所有层面沿病灶轮廓逐层放置感兴趣区(region of interest, ROI)，去除钙化区域进一步调整ROI。将肺结节原始图像和分割好的肺结节立体ROI图像导入Artificial Intelligent Kit(AK)软件。通过AK软件对数据进行异常值处理、数据划分、数据预处理，然后进行单因素方差分析+秩和检验，Spearman相关性分析，Lasso回归及十折交叉验证，提取影像直方图、形态学、灰度共生矩阵(GLCM)、灰度游程长矩阵(RLM)4个方面的影像组学特征。

1.4 EGFR基因位点突变检测 采用人EGFR基因突变检测试剂盒(武汉默沙克生物科技有限公司)，进行荧光定量PCR检测。存在EGFR基因19、21位点突变的病例为EGFR突变组(阳性组)，不存在EGFR基因19、21位点突变的病例为EGFR野生型组(阴性组)。

1.5 Ki-67蛋白表达检测 采用即用型快捷免疫组化MaxVisionTM 2/HRP试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)进行检测。细胞核呈黄色或者棕色者为Ki-67蛋白表达阳性，由两位高年资病理医师根据切片中细胞核染色程度分为Ki-67阳性组和Ki-67阴性组。

1.6 统计学方法 影像组学特征数据统计采用AK软件自带的统计软件，其余数据采用统计学软件SPSS 19.0。计量资料比较采用t检验，计数资料比较采用χ2检验，等级资料指标相关性分析采用Spearman相关性分析(r≥0.8，两变量间高度相关；0.5 ≤r<0.8，两变量中度相关；0.3 ≤r<0.5，两变量低度相关；r<0.3，两变量低度相关程度弱，基本不相关)，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺影像组学特征 120例肺结节的原始图像与分割后的图像一起导入AK软件，共获取396个影像组学特征，采用单因素方差分析+秩和检验方法降维后筛查出221个特征。进一步对221个特征使用Spearman相关性检验方法去冗余后剩余75个特征，最后选用Lasso降维方式及十折交叉验证，特征数降至5个，见表1。

表1 通过降维筛选的5个肺影像组学特征

注：RLM：灰度游程长矩阵；GLCM：灰度共生矩阵。

2.2 肺结节患者EGFR基因突变和Ki-67表达情况 不同性别，年龄段肺结节患者的EGFR基因突变和Ki-67表达阳性率比较，差异无统计学意义(P>0.05)；与肉芽肿性病变比较，微浸润性腺癌和浸润性腺癌的EGFR基因突变阳性率均增高，原位癌、微浸润性腺癌和浸润性腺癌的Ki-67表达阳性率均增高，差异均有统计学意义(P<0.05)；见表2。

表2 肺结节患者EGFR基因突变和Ki-67表达情况

注：*与肉芽肿性病变比较，P<0.05。

2.3 影像组学特征与EGFR基因突变和Ki-67表达情况相关性分析 EGFR基因突变与Inertia_AllDirection_offset4参数正相关(r=0.564,P=0.040)，Ki-67蛋白表达分别与ShortRunlEmphasis_AllDirection_offset1(r=0.359,P=0.042), InverseDifferenceMoment_AllDirection_offset4(r=0.549,P=0.038), Inertia_AllDirection_offset4(r=0.423,P=0.047)正相关，见表3。

表3 肺结节患者影像组学特征与EGFR基因突变和Ki-67表达情况相关性分析

3 讨论

传统的影像测量方法不能准确反映肿瘤的微观变化，医学影像分析模式需从传统的医师主观判断向精准定量分析模式转化。目前影像组学已经发展成为融合影像、基因、临床等信息的辅助诊断、分析和预测的工具[8-9]。CT影像组学在预测非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)分子特征方面具有较大的优势，有望在肺癌的个体化治疗方面发挥重要作用。本研究共观察120例肺结节的CT影像，使用AK软件对良恶性肺结节定量特征降维，筛选得到5组有统计学差异的影像组学特征。

张连美等[10]研究显示，肺癌EGFR基因突变阳性率为62.9%。本研究90例肺腺癌中，EGFR基因突变阳性率为25.56%(23/90)，阳性率低于文献报道，可能与张连美等的研究没有限制肺肿瘤的类型及大小有关。有研究表明[11]，肿瘤的类型及大小与EGFR基因突变率有一定的相关性，肺鳞癌组织中EGFR基因突变阳性率高于肺腺癌组织中EGFR基因突变阳性率，肺肿瘤直径越大，EGFR基因突变阳性率越高。本研究纳入的恶性肺结节均为肺腺癌且直径均小于3 cm，可能是导致EGFR基因突变阳性率相对较低的原因。本研究结果显示，与肉芽肿性病变比较，微浸润性腺癌和浸润性腺癌的EGFR表达阳性率均明显增高，提示肺腺癌与EGFR基因突变有一定的关联[4,11-12]。本研究的EGFR基因突变与影像组学特征的相关性分析结果显示，EGFR基因突变与肺纹理特征Inertia_AllDirection_offset4参数呈中度相关性。Inertia反映图像的清晰度和纹理沟纹深浅的程度，本研究结果提示EGFR基因突变在微观形态上可改变肺CT图像纹理沟的深度。有研究采用CT影像组学特征预测NSCLC的EGFR突变状态[13]，结果显示影像组学预测EGFR突变状态的ROC曲线下面积达到0.89。

Ki-67蛋白存在于细胞核内，Ki-67能客观地反映机体细胞的增殖活性[14]。Ki-67的表达强度与肺癌淋巴结转移、临床分期密切相关，高表达可作为肿瘤转移的标志；Ki-67阳性表达率与肺腺癌的分化程度呈负相关，Ki-67标记指数已成为鉴别肿瘤良恶程度及侵袭力的重要标志之一[15-17]。本研究结果显示，90例肺腺癌中，Ki-67表达阳性率为67.78%(61/90)；与肉芽肿性病变比较，原位癌、微浸润性腺癌和浸润性腺癌的Ki-67表达阳性率均明显增高。同时本研究结果显示，Ki-67蛋白表达分别与ShortRunlEmphasis_AllDirection_offset1, InverseDifferenceMoment_AllDirection_offset4, Inertia_AllDirection_offset4呈正相关，提示Ki-67蛋白的表达可改变肺CT图像的光滑程度和纹理沟的深浅，改变图像局部纹理的同质性；通过肺纹理特征，可以较低的成本、客观地判断肿瘤的增殖活性，可更早更快速地对肺腺癌进行诊治和预后。

综上，肺结节组织中EGFR基因位点突变和Ki-67蛋白表达与肺腺癌影像组学特征有一定的相关性，结果还需从扩大肺结节病理类型、扩大样本量、增加机器型号、优化扫描参数等方面进一步验证。