改良PCR-RFLP法检测MTHFR基因C677T位点多态性

何震宇,顾取良,游娟

(广东药科大学生物化学与分子生物学系，广东 广州 510006)

5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是叶酸代谢途径的关键酶，其编码基因定位于1p36.3[1],全长2.2 kb，包含11个外显子[2]。MTHFR基因错义突变是引起酶活性缺乏和降低的主要机制，最常见的一个突变是DNA分子第677位碱基发生C→T 的突变(C677T)，它会导致编码肽链第222位的丙氨酸被缬氨酸取代，从而降低MTHFR的热稳定性和活性,杂合子(TC)个体的MTHFR活性降低35%，突变纯合子(TT)个体的MTHFR活性降低70%[3]。MTHFR活性下降可引起血浆同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)水平上升、一碳单位代谢障碍，与唐氏综合征[4]、神经管缺陷[5]、唇腭裂[6]、心脑血管疾病[7]、自闭症[8]、反复自然性流产[9]、肿瘤[10]等多种疾病的发生相关。加强MTHFRC667T基因分型研究，对临床疾病诊断、风险性预测及指导医生用药等有重要意义。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

口腔拭子基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司)；2×HS PCR Mix(广州东盛生物科技有限公司)；上游引物FP：5′-CTGGGGTCAGAAGCATATCAGTCATG-3′及下游引物RP：5′-AAGCAACGCTGTGCAAGTTCTGG-3′(自行设计，北京六合华大基因科技股份有限公司合成)；HinfI(Thermo Fisher Scientific Inc)；DNA分子量标准low ladder(广州东盛生物科技有限公司)。

1.2 主要仪器

5804R型低温高速离心机(德国Eppendorf 公司)；DDY- 6c型电泳仪(北京市六一仪器厂)；凝胶成像分析仪(英国 Syngene 公司)；2720型PCR仪(美国ABI公司)。

1.3 研究对象

正常口腔拭子标本100例，采自广东药科大学在读本科生，其中男57例，女43例，平均年龄20.28岁，事先均签署了知情同意书。

1.4 DNA制备

准备消毒的医用棉签，志愿者先用清水漱口，然后手持棉签伸进口腔，在口腔内侧(腮帮子)上反复擦拭10次左右，取出棉签，-20 ℃保存。按试剂盒说明书提取基因组DNA。

1.5 引物设计

根据NCBI中MTHFR基因全序列(登录号：NG_013351.1)及dbSNP数据库的序列信息(编号：rs1801133)，采用primer premier 5.0软件辅以人工修改设计引物，使用在线Primer-BLAST程序验证引物的特异性。最终选定的引物与模板的对应关系见图1。

图1PCR的模板序列及引物结合位置
Figure1Template sequence and primer binding location of PCR

上述序列中2个末端的大写碱基为引物的对应位置，以突变型等位基因为模板的PCR产物在多态位点附近含有GAGTC序列，它能被HinfI(G^ANTC)识别切割；相反，以野生型等位基因为模板的PCR产物在多态位点附近的相应序列为GAGCC序列，它不能被HinfI识别切割。此外，野生型等位基因、突变型等位基因的PCR产物在多态位点上游均包含1个GACTC序列【104～108位】，其为HinfI识别位点。

1.6 PCR扩增及产物的电泳鉴定

PCR总体积25 μL，其中2×HS PCR Mix 12.5 μL、上下游引物各10 pmol、基因组DNA 1 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性3 min，然后94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 35 s，共计30个循环，再于72 ℃延伸7 min。PCR产物用2.0%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，得到预期大小的片断后，再进行下一步的酶切反应。

1.7 PCR产物的酶切分型

酶切反应体系30 μL，其中PCR产物10 μL、FastDigest Green Buffer 2 μL、FastDigestHinfI 1 μL、灭菌三蒸水17 μL，37 ℃水浴消化10 min。酶切产物经3.0%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，根椐限制性酶切图谱确定每份样品C677T位点的基因型。

1.8 测序验证

随机选取上述PCR-RFLP法检出的3种基因型样品各1例，PCR扩增535 bp的靶序列测序，测序引物采用PCR上游引物FP。

1.9 统计学处理

基因型和等位基因频率采用直接计数法，Hardy-Weinberg遗传平衡定律的吻合度检验采用χ2检验。

2 结果

2.1 改良PCR-RFLP法对MTHFR基因 C677T 位点的鉴定

PCR产物理论大小为535 bp(见图2中的P),用HinfI进行酶切，野生型等位基因677C可得到429.5、105.5 bp 2种片段，突变型等位基因677T可得到264.5、165、105.5 bp 3种片段。故野生型纯合子CC的条带应为429.5、105.5 bp；突变型纯合子TT的条带应为264.5、165、105.5 bp；杂合子CT的条带应为429.5、264.5、165、105.5 bp，事实上，仅通过429.5、264.5 bp 2种特征片段就可从电泳图谱上清晰地分辨出CC、CT、TT 3种基因型(图2)。测序结果(图3)表明，本研究建立的改良PCR-RFLP法对3种基因型样品的分型结果完全正确。

MP123456789101112bp700500400300200150100535429.5264.5165105.5

M. DNA分子量标准； P. PCR产物；1、3、5、6、8、9、10、11.野生型纯合子CC； 2、7、12. 杂合子CT； 4.突变型纯合子TT。

图2改良PCR-RFLP检测MTHFR基因C677T位点基因型之电泳图谱

Figure2Electrophoresis map for genotyping C677T locus ofMTHFRgene by improved PCR-RFLP

abcd

a.中框内序列为内对照酶切位点； b、c、d.中圆角矩形圈住的碱基为多态位点碱基， 相应的基因型分别为野生型纯合子CC，杂合子CT，突变型纯合子TT。

图3MTHFR基因C677T位点3种基因型样品测序峰图

Figure3Sequencing map of three genotypes of C677T locus ofMTHFRgene

2.2 Hardy-Weinberg 遗传平衡检验

本研究检测到CC、CT、TT 3种基因型的例数分别为：59、35、6，相应的基因型频率分别为0.59、0.35、0.06。等位基因C的频率为0.765，等位基因T的频率为0.235。经Hardy-Weinberg 遗传平衡检验，χ2=0.0723(P=0.965>0.05)，说明样本具有群体代表性。

3 讨论

由于MTHFR基因多态性与临床上多种疾病的发生、发展密切相关，故临床开展MTHFR基因多态性检测意义重大、前景广阔。目前，国内外用于MTHFR基因C677T位点(rs1801133)的分型方法有直接测序(Sanger 双脱氧链终止法)[11]、焦磷酸测序[12]、微测序[13]、基于引物延伸反应的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)基因分型技术[14]和荧光偏振光基因分型技术[15]、基因芯片[16]、Taqman探针法[17]、高分辨率熔解曲线(HRM)法[18-19]及PCR-RFLP[20-25]等，各有其优点及局限性。

PCR-RFLP是一种经典的基因分型方法，相较于大多数方法而言，不需要贵重仪器，技术简单，容易实现，因而在MTHFR基因C677T位点的检测中应用广泛。不过，通过分析(表1)，不难发现，既有方法在PCR产物酶切不完全时，残留的PCR产物容易导致TT型(突变型纯合子)样品被误判为CT型(杂合子)(图4)。在薛丽等[15]的实验中就出现过这种情形：他们用PCR-RFLP检测了100例标本，发现了48例CT杂合子，用TDI-FP、Pyrosequencing测序2种方法均证实其中有2例所谓的“CT杂合子”属于误判，实质上为TT纯合子。

表1 采用PCR-RFLP法鉴定MTHFR基因C677T位点的引物及基因型判断依据Table 1 Primers and genotype judgment basis for identification of MTHFR gene C677T locus by PCR-RFLP

完全酶切图 不完全酶切图

图4既有PCR-RFLP法检测MTHFR基因C677T位点之完全酶切及不完全酶切示意图

Figure4Complete and incomplete digestion maps ofMTHFRgene C677T locus detected by existing PCR-RFLP method

本研究对既有PCR-RFLP分型法进行了改良，通过巧妙的引物设计使得所有样品的PCR产物在多态位点之外均包含一个HinfI识别位点作为酶切效果的内对照，一旦在该位点发生切割，得到的所有真正反映样品基因型的酶切片段的大小必然小于PCR产物的大小(即局部小于整体)，不会由于PCR产物的残留干扰基因型判断。如图2所示，仅凭橙色框中的429.5、264.5 bp片段的组合情况就可清晰区分3种基因型样品，它们的大小均小于PCR产物(535 bp,绿色框框住的条带)。除了引入酶切内对照确保分型结果的准确性外，本法还具有如下优点：(1)只涉及离心、PCR、酶切、电泳等常规分子生物学技术，操作较为简便；(2)通过酶切产物的电泳图谱判断基因型，结果非常直观；(3)不需昂贵的仪器设备和试剂，可极大地降低实验成本；(4)酶切反应时间极短(FastDigest快速内切酶可在10 min内完成酶切反应)，而常规酶切反应需要数小时乃至过夜[23-24]，故可极大节省检测时间。总之，改良PCR-RFLP法准确、简便、快速、成本低廉，对实验平台要求不高，在临床检测上有较高的推广应用价值。此外，该法还可用于流行病学调查以促进相关疾病发病机制的深入研究。