循环肿瘤细胞检测对胃癌新辅助化疗疗效的评估价值

付汉东，寇继光，刘汉中，张爱华，王雪菲，阳仕雄，胡校云，沈婷，鲁艳，魏威

(湖北省孝感市中心医院/武汉科技大学附属孝感医院中心实验室，湖北 孝感 432100)

胃癌是最常见的消化道肿瘤之一，具有较高的发病率和死亡率。新辅助化疗(neoadjuvant chemotherapy,NAC)是胃癌综合治疗的重要部分，可有效提高胃癌患者手术根治率，若在NAC进程中能及时评估治疗效果，进而指导调整化疗方案，有利于胃癌的精准个体化治疗。临床上胃癌患者的治疗效果主要依靠病理评价和影像学检查进行评估，但前者具有明显的有创性、滞后性，后者缺乏特异性，准确率低。循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)于1869年被澳大利亚学者Ashworth首次提出，是指自发或因诊疗操作由原发肿瘤或者转发性病灶脱落进入血液循环系统的肿瘤细胞[1]。近年来，已有较多研究[2-3]表明CTCs在多种肿瘤的早期诊断、预后评估等具有重要的临床意义，但目前关于CTCs评估胃癌NAC疗效的研究较少，且存在争议。本课题采用差异富集-荧光免疫染色原位杂交技术(Subtraction Enrichment-Immunofluorescence in situ hybridization,SE-iFISH)检测胃癌患者外周血中的CTCs，旨在探讨CTCs检测在胃癌患者NAC疗效评估中的价值。现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年10月—2018年10月我院收治的胃癌患者，纳入标准：①术前经胃镜活检病理证实为胃恶性肿瘤，诊断参照《中华人民共和国卫生行业标准：胃癌诊断标准(WS316-2010)》[4]；②TNM分期为Ⅲ期；③入组前未接受任何辅助性治疗；④有术前新辅助化疗指征，并在我院接受新辅助化疗；⑤本研究经医院伦理委员会批准，所有患者自愿参加并签署书面知情同意书。排除标准：①合并其他部位恶性肿瘤；②具有化疗禁忌证；③因病情出现变化或患者依从性差，不能按既定方案进行新辅助化疗。

1.2 方法

1.2.1 治疗方法 胃癌患者接受FOLFOX4方案进行新辅助化疗，d1：注射用奥沙利铂85 mg/m2静脉滴注，>2 h；注射用亚叶酸钙200 mg/m2静脉滴注，>2 h；氟尿嘧啶注射液400 mg/m2静脉推注，<30 min，然后600 mg/m2持续静脉泵入，5 mL/h。d2：注射用亚叶酸钙200 mg/m2静脉滴注，>2 h；氟尿嘧啶注射液400 mg/m2静脉推注，<30 min，然后600 mg/m2持续静脉泵入，5 mL/h。14 d为1个周期，共接受2个周期。所有患者均于化疗结束4周后行胃癌根治术，且手术顺利，无明显并发症。

1.2.2 病理观察及化疗效果判定 详细记录胃癌患者性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、组织分化程度。手术切除瘤体后进行病理检查，依据病理学Miller-Payne评定标准评估NAC疗效，根据残留肿瘤细胞的百分比分为Ⅰ～Ⅴ级，以Ⅲ～V级定义为化疗有效，Ⅰ～Ⅱ级定义为化疗无效[5]。

1.2.3 CTCs检测 胃癌患者分别于化疗前、化疗后清晨空腹状态下采集外周血6 mL，弃去穿刺后的前2 mL，以避免穿刺过程中皮肤上皮细胞的污染而造成的假阳性结果。采集所得的血样置于EDTA抗凝管中，轻柔颠倒2～3次混匀，常温避光静置保存，采集后5 h内处理标本。通过SE-iFISH技术检测胃癌患者外周血CTCs，人外周循环肿瘤细胞鉴别试剂盒购自北京莱尔生物医药科技有限公司。CTCs判定标准为细胞核4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色阳性，上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)染色阳性或阴性，8号染色体着丝粒探针(centromeric probe 8,CEP8)染色阳性的信号点≥3个，检测到3个以上CTCs即为CTCs阳性[6]。胃癌患者以NAC前后CTCs检出数目降低定义为化疗有效，NAC前后CTCs数目不变或者升高定义为化疗无效[7]。

1.3 质量控制

①严格按照纳入标准、排除标准纳入研究对象；②胃癌患者治疗效果均由经验丰富的肿瘤外科医生依据相关标准进行评定；③胃癌患者组织病理学检查、CTCs检测均由我院经验丰富的同组检验科医生进行；④所有研究数据均详细记录，录入前进行核对、补漏，录入员采用双轨录入法录入数据资料，确保所有数据的可靠性和真实性。

1.4 统计学数据处理

2 结果

2.1 胃癌患者的临床病理特征

本研究共纳入90例胃癌患者。①性别：男59例(65.56%)，女31例(34.44%)；②年龄：27～74岁，平均(53.91±14.67)岁，其中>50岁共48例(53.33%)、≤50岁42例(46.67%)；③肿瘤位置：胃窦38例(42.22%)，其他52例(57.78%)；④ 肿瘤浸润深度：T1-212例(13.33%)、T3-478例(86.67%)；⑤ 淋巴结转移：N030例(33.33%)、N1-360例(66.67%)；⑥组织分化程度：低分化26例(28.89%)、中分化31例(34.44%)，高分化33例(36.67%)；⑦ 病理分期ⅢA期37例(41.11%)、ⅢB期31例(34.44%)、ⅢC期22例(24.45%)。

2.2 NAC前胃癌患者CTCs检出情况及其与临床病理特征的关系

NAC前胃癌患者外周血CTCs阳性率为86.67%(78/90)，在肿瘤浸润深度T3-4及淋巴结转移N1-3患者中CTCs检出率更高，与患者性别、年龄、肿瘤位置、组织分化程度、病理分期无关(P>0.05)。见表1。

表1 NAC前CTCs检出情况及其与胃癌患者临床病理特征的关系

Table1Detection of CTCs before NAC and its relationship with clinicopathological features of patients with gastric cancer [n(%)]

病理特征例数CTCs阳性(n=78)阴性(n=12)χ2值P值性别0.5470.460 男5950(64.10)9(75.00) 女3128(35.90)3(25.00)年龄/a0.9890.320 ≤504238(48.72)4(33.33) >504840(51.28)8(66.67)肿瘤位置0.0020.967 胃窦3833(42.31)5(41.67) 其他5245(57.69)7(58.33)肿瘤浸润深度4.7930.029 T1-2128(10.26)4(33.33) T3-47870(89.74)8(66.67)淋巴结转移6.9230.009 N03022(28.21)8(66.67) N1-36056(71.79)4(33.33)组织分化程度1.0070.316 低分化2624(30.77)2(16.67) 中、高分化6454(69.23)10(83.33)TNM分期1.4850.223 ⅢA期3734(43.59)3(25.00) ⅢB、ⅢC期5344(56.41)9(75.00)

2.3 NAC前后胃癌患者CTCs的变化情况

与NAC前比较，胃癌患者NAC后CTCs阳性率明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.3 CTCs检测对胃癌评价NAC疗效的研究评估价值

90例胃癌患者NAC治疗总有效率为75.56%(68/90)。NAC前后CTCs检出数目降低、不变或升高评估疗效的敏感度、特异度、准确性分别为88.24%、68.18%、83.33%。CTCs检测评价结果与金标准评估疗效中度一致(Kappa=0.556,P<0.001)。见表3。

表2 胃癌患者NAC前、NAC后CTCs的比较(n=90)

Table2Comparison of CTCs between before and after NAC in patients with gastric cancer (n=90)

NAC例数CTCs阳性阴性χ2值P值NAC前90781229.4060.000NAC后904446

表3 CTCs检测与病理学Miller-Payne标准评估胃癌患者NAC疗效的比较(n=90)

Table3Comparison of evaluating value on efficacy of NAC in patients with gastric cancer between CTCs detection and pathology Miller-Payne criteria (n=90)

CTCs检测Miller-Payne标准有效无效合计有效60767无效81523合计682290

3 讨论

在恶性肿瘤患者的外周血中，只有极少数CTCs，几乎每10～100万个白细胞中只有1个CTCs，因此对CTCs检测技术的灵敏性和特异性均提出了极高要求[8]。与CellSearch系统等通过检测EpCAM的CTC的传统方法相比，阴性富集法与荧光免疫染色原位杂交技术相结合，可避免因上皮细胞向间质细胞转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)导致的CTCs假阴性结果，且可有效鉴别非血源性染色体数目异常的CTCs，明显提高阳性率[9-10]。本研究应用这种方法检测了90例胃癌患者外周血CTCs，结果显示CTCs阳性率为86.67%(78/90)，与国内相关文献[11]报道接近。

目前研究[12]表明，部分恶性肿瘤患者在早期阶段即可出现肿瘤细胞于原发灶脱落进入血液循环形成CTCs，且恶性程度越高的恶性肿瘤患者血液循环中CTCs数目越多，但CTCs数目与肿瘤恶性程度的关系尚未完全明确。孙建兵等[11]研究提到胃癌患者空腹外周静脉血中CTCs水平与肿瘤浸润深度、淋巴结转移及TNM分期有关。Okabe等[13]研究也提到CTCs阳性率与TNM分期、肿瘤分化程度有关。然而，本研究对CTCs检出情况与胃癌患者临床病理特征的关系进行分析，发现CTCs阳性率与肿瘤浸润深度、淋巴结转移显著相关，但与患者性别、年龄、肿瘤位置、组织分化程度、病理分期无关，这与上述研究结果不符，分析其原因可能与CTCs检测方法不同、纳入研究样本数量的差异有关，但总体反映了CTCs检出情况与肿瘤恶性程度有关。

病理评价是评估疗效的金标准，但该法存在明显的有创性、滞后性，不能及时反映原发肿瘤对NAC的反应[14]。NAC后恶性肿瘤患者CTCs变化是否与NAC疗效有关，目前国内外尚未取得统一的结论。Serrano等[15]发现，NAC后持续存在的CTCs与原发肿瘤患者临床获益与否无直接关系。Tong Bing等[16]研究也提出基线CTCs数目与晚期非小细胞肺癌化疗反应之间无相关性。而Liu等[17]研究表明基线CTCs数目少或化疗后CTCs数目减少的晚期胃癌患者可在化疗中获益。本研究结果显示，NAC后胃癌患者外周血CTCs阳性率较NAC前明显降低，表明NAC可有效杀灭胃癌患者外周血CTCs。以NAC前后CTCs检出数目降低和不变或者降低分别定义为化疗有效和无效，其评估NAC疗效的敏感度、特异度、准确性分别为88.24%、68.18%、83.33%，与金标准评估疗效中度一致(Kappa=0.556,P<0.001)，表明CTCs检测在一定程度上可反映胃癌患者NAC疗效。

综上所述，CTCs检测有助于评估胃癌的恶性程度，对评价NAC疗效具有一定的临床价值。由于本研究纳入研究样本量相对较少，且未对胃癌患者根治术后转移、复发等情况进行随访，缺乏CTCs检测与胃癌患者术后预后的关系分析，故今后仍需进一步扩充病例、延长随访时间，开展前瞻性、大样本、多中心的临床研究进行相关验证。