延胡索乙素在气虚大鼠皮肤上的渗透动力学研究

梁庆，王晖

(1.广东安健医药有限公司，广东 广州 510224； 2.广东药科大学中药学院，广东 广州 510006)

气虚证是临床常见证型，影响体内多个组织、系统，与多种疾病相关，多由久病体虚、劳累过度、年老体弱、营养不良等原因引起，主要临床表现有少气懒言、神疲乏力、头晕目眩、自汗等，活动时诸症加剧，舌淡苔白、脉虚无力等[1-2]。近年来，对气虚证的研究主要集中在临床表现的量化评分、免疫指标的变化、呼吸和循环功能检测等方面，而对于气虚证对皮肤的影响较少涉及。本研究通过游泳疲劳法制造气虚模型，考察模型药物延胡素乙素在气虚动物皮肤上的渗透动力学情况，为经皮给药制剂在气虚证患者的使用提供指导。

1 材料与方法

1.1 动物

SD大鼠，SPF级，雄性，体质量(300±20)g，由南方医科大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK粤2016-0041。

1.2 药品与试剂

延胡索乙素(湛江南国药厂惠赠，批号：160109，质量分数：99.5%)；延胡索乙素对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110726-2010)；无水乙醇(广州化学试剂厂，分析纯)。

1.3 仪器

UV-1800紫外分光光度计(北京瑞利仪器有限公司)；THZ-82型水浴恒温振荡器(金坛市宏华仪器厂制造)；FEJ-H3000电子天平(福州富日衡之宝电子有限公司)；YP102N型电子天平(上海恒平科学仪器有限公司)；透皮扩散装置(自制)；RM2235手动转轮切片机(德国徕卡)；EG1160包埋机(德国徕卡)；IX51倒置光学显微镜(日本Okympus公司)。

1.4 延胡索乙素质量分数测定方法[3]

1.4.1 检测波长的确定 取质量分数1%延胡索乙素的95%(体积分数，下同)乙醇溶液，以95%乙醇为参比溶液，于200～400 nm波长扫描延胡索乙素紫外吸收光谱，结果显示在281 nm波长处有最大吸收值，故选取281 nm作为检测波长。

1.4.2 标准曲线的制备 精密称定延胡索乙素对照品0.051 3 g，用95%乙醇溶解并定容至50 mL容量瓶中作为储备液。精密量取以上储备液1.5、2.5、4.0、5.0、6.0 mL分别置于100 mL容量瓶中，用95%乙醇定容，即得质量浓度为15.39、25.65、41.04、51.30、61.56 μg/mL延胡索乙素对照品溶液。在281 nm波长下测定各溶液的吸光度(A)，得回归方程A=0.014 3ρ-0.000 1，r=0.999 0，线性范围为15.39～61.56 μg/mL。

1.4.3 方法学试验[4]

1.4.3.1 精密度试验 取质量浓度为41.04 μg/mL的延胡索乙素对照品溶液，连续测定5次，测定吸光度，计算RSD值。结果显示，RSD值小于2%，说明仪器精密度良好。

1.4.3.2 稳定性试验 取质量浓度为41.04 μg/mL的延胡索乙素对照品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h测定吸光度，计算RSD值。结果显示，RSD小于2%，说明样品在室温下放置24 h内稳定。

1.4.3.3 回收率试验 精密量取“1.4.2”项下储备液1.5、3.0、6.0 mL，分别置于100 mL容量瓶中，用95%乙醇定容，得质量浓度为15.39、30.78、61.56 μg/mL的样品溶液，测定吸光度，计算回收率及RSD值。结果显示，回收率在95%～105%之间，RSD小于2%，说明测定方法准确、可靠。

1.5 透皮吸收试验方法

1.5.1 大鼠分组及气虚模型的建立[5]大鼠适应性饲养3 d，随机分成正常组与气虚组。正常组常规饲养；气虚组控制食量，每天8:00～20:00正常给食，20:00～次日8:00不给食，每天14：00将大鼠放进恒温水槽[水温(32±2)℃，水深45 cm]中游泳，当出现自然沉降时从水槽中捞出，有60%以上的大鼠出现自然沉降时全部捞出，连续进行2周，完成造模。造模完成后，观察并对比正常大鼠与气虚大鼠的外观表现；通过制备病理切片，从微观角度对比正常皮肤与气虚皮肤的特点。

1.5.2 离体皮肤的制备 气虚大鼠和正常大鼠分别用手术剪刀将背部的毛剪短，再用电动剃须刀剃至无毛状态，用温水洗净皮肤，继续适应性饲养24 h。24 h后麻醉处死，剥取背部皮肤，选择无肉眼可见伤痕的皮肤，去除皮下脂肪，用生理盐水反复冲洗，直至无混浊为止，放-4 ℃冰箱中保存，于第2天使用。

1.5.3 释放液和接收液的制备 释放液的制备：精密称取延胡索乙素0.104 2 g，溶解于10 mL 95%乙醇中，避光保存。接收液为20%乙醇生理盐水溶液。

1.5.4 透皮试验[6]上述大鼠皮肤，常温下解冻，在双室透皮扩散装置进行体外透皮实验。大鼠皮肤固定于样品池与接收池之间，角质层面向样品池，样品池注入释放液0.1 mL，接收池注入接收液5 mL，温度为(32.0±1.0) ℃，振速为120 次/min，扩散面积为0.502 cm2。在2、4、8、12、24 h 分别取接收液4.0 mL(每次取样后补回等量的接收液)，样品经适当稀释后在281 nm波长下测定吸光度，代入回归方程计算浓度，再按下式算出不同时间段的累积渗透量(Q)：

式中：Q为累积渗透量，Cn为第n个取样点的药物浓度(mg/L)；Ci为第i个取样点的药物浓度(mg/L)；A为扩散面积(cm2)。

以累积渗透量(Q)对时间(t)进行线性回归拟合，所得的方程斜率即为透皮速率(Kp)。

1.6 大鼠皮肤的病理切片(石蜡切片法)[8]

分别取正常大鼠和气虚大鼠背部皮肤，剪成2 mm×2 mm的片状，浸泡于5%的中性甲醛溶液中保存。按常规方法进行HE组织切片，在显微镜下观察。

1.7 数据处理

2 结果

2.1 正常大鼠与气虚大鼠的形态比较

2.1.1 正常大鼠与气虚大鼠外观比较 造模过程中，正常大鼠活动次数多，精神良好，反应较为敏捷，粪便体积大，排便次数少；而气虚大鼠相对活动次数少，反应较为迟钝，粪便体积小，排便次数多。造模后，正常大鼠毛色油亮，呈淡黄色，皮肤油脂较多，而气虚大鼠毛色枯燥、偏白，皮肤油脂少。正常大鼠离体皮肤较厚，毛孔大、多且密，含有大量油脂，呈粉红色；气虚大鼠离体皮肤较薄，毛孔小、少且疏，油脂较少，皮肤颜色较正常组浅。

2.1.2 正常大鼠与气虚大鼠体质量比较 正常大鼠与气虚大鼠造模前后的体质量变化情况见表1。可见，正常组大鼠在造模前后的体质量没有明显变化，而气虚组大鼠的体质量在造模前后的差异具有统计学意义(P<0.05)；造模后，气虚组大鼠和正常组大鼠的体质量差异也具有统计学意义(P<0.01)。

表1 造模前后大鼠体质量的比较

组别造模前造模后正常组305.5±15.8317.5±10.1气虚组304.6±14.7212.8±6.9∗##

与造模前比较：*P<0.05；与正常组比较：##P<0.01。

2.1.3 气虚大鼠与正常大鼠离体皮肤微观结构比较 从图1可见，显微镜下正常鼠皮上皮细胞排列较为疏松，细胞间隙较大，上皮组织薄，脂肪等吸水性物质较多，脂肪层厚；气虚鼠皮相对正常鼠皮其上皮组织细胞排列紧密，脂肪较少。

A.正常大鼠皮肤； B.气虚大鼠皮肤。

图1气虚大鼠与正常大鼠离体皮肤的微观结构(100×)

Figure1Microstructure of skininvitroof Qi deficiency rats and normal rats(100×)

2.2 延胡索乙素的透皮效果

延胡索乙素在正常大鼠和气虚大鼠皮肤上的累积渗透量与透皮速率结果见表2。可见，气虚大鼠皮肤及正常大鼠皮肤的渗透系数分别为(97.6±8.6) μg/(cm2·h)和(188.3±10.7) μg/(cm2·h)，气虚组的渗透系数显著低于正常组(P<0.01)。

表2 延胡索乙素在正常大鼠和气虚大鼠皮肤上的透皮效果

组别Q/(μg·cm-2)2 h4 h8 h12 h24 hKP/(μg·cm-2·h-1)正常组1 783.4±87.02 268.1±139.82 832.0±207.73 338.3±322.84 011.6±318.5188.3±10.7气虚组940.4±89.21 113.7±86.61 294.4±110.11 432.5±123.61 683.6±140.997.6±8.6∗∗

与正常组比较：**P<0.01。

3 讨论

气虚包括脾、肺气虚，是指在疾病过程中，气的生化不足或耗散太过而致气的亏损，从而使脏腑组织功能活动减退，抗病能力下降的病理状态，可以出现在任何脏腑组织[9]。中医认为脾胃为后天之本、气血化生之源，人体脏腑器官、营卫经络、形体官窍、肌肤皮毛无不仰仗脾胃。脾胃健旺水谷精微化源充足，精气充盛，脏腑功能强盛，则形健神旺，面色红润；若脾胃衰老化源不足，则五脏无以养，气血日衰，脏腑虚损，导致衰老，皱纹横生；另一方面，脾胃衰弱，则痰浊瘀血内生，加速衰老而面色晦暗[10]。

《素问·五脏生成篇》说：“肺之合皮也，其荣毛也，其主心也”、“肺主皮毛”、“肺合皮毛”及“肺生皮毛”等都体现了肺与皮毛之间的关系。“皮毛”为一身之表，主要由汗腺、皮肤与毫毛等组织组成，主要对汗液分泌、水液代谢及呼吸和抵御外邪之功能起调节作用，是人体中一个强大的免疫器官，助人体抵抗外邪[11-12]。《灵枢》所云“肺气弗营，则皮毛焦，皮毛焦则津液去，津液去则皮枯毛折”[10]，可见气虚可导致皮肤结构的改变。

皮肤角质层由角质细胞和其间的脂质组成，是多层致密的膜结构，二者共同维持皮肤正常的屏障功能。角质细胞间排列紧密，对水分及一些化学物质具有屏障作用，防止水分的蒸发。有人将角质层形象地比喻为用砖砌成的墙，角质细胞与脂质构成一道致密的屏障而阻止药物等外界因素对其的影响。本研究发现正常鼠皮上皮细胞排列较为疏松，细胞间隙较大，上皮组织薄，脂肪层厚；气虚鼠皮相对正常鼠皮其上皮组织细胞排列紧密，脂肪较少，说明气虚导致了皮肤结构的改变。本研究以延胡索乙素为模型药物，对其在正常皮肤和气虚模型皮肤上的渗透性差异进行了研究，结果显示，气虚模型大鼠皮肤的渗透系数显著低于正常大鼠的(P<0.01)，表明气虚导致了皮肤结构的改变，对延胡索乙素的渗透有阻滞作用。