5种检测化妆品中金黄色葡萄球菌方法的比较

陶明，王媛，郭琦，蔡克亚，赵高岭

(1.河南省食品药品检验所，河南 郑州 450008； 2.郑州安图生物工程股份有限公司,河南 郑州 450000)

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属(Staphylococcus)，有“嗜肉菌"的别称，是革兰阳性菌的代表，可引起许多严重感染。美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第2位，仅次于大肠杆菌。化妆品中的金黄色葡萄球菌也是卫生学检验的重要致病菌指标之一，检验的依据为《化妆品安全技术规范》(2015年版)中规定的培养法，鉴定主要依赖于菌落形态、染色特性、显微镜下形态特征、生化反应以及选择性培养基等，但这种传统的鉴定方法繁琐、耗时长，同时也会受到培养时间以及检验人员经验能力等一些人为因素的影响。选用合适的鉴定系统是提高实验室能力的重要保障。本实验室收到中国食品药品检定研究院组织NIFDC-PT-188 化妆品中金黄色葡萄球菌检验能力验证盲样2个：CODE1和CODE2,结合目前对微生物鉴定的常用手段[1-4]，本实验室采用VITEK2 Compact、杜邦BAX Q7、miniVIDAS、MALDI-TOF质谱(Autof ms1000)、国标法联合检测盲样中是否存在金黄色葡萄球菌。最后建立本实验室药品化妆品微生物联合检测程序，提高实验室微生物检测能力。

1 材料

1.1 样品

金黄色葡萄球菌盲样CODE1和CODE2,由中国食品药品检定研究院提供。

1.2 仪器

BD240 恒温培养箱(德国BINDER)；JY10002电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；ESCO生物安全柜(新加坡ESCO科技有限公司)；Yamato SQ810C 立式压力蒸汽灭菌器(重庆雅马拓科技有限公司)；VITEK 2 Compact 自动微生物快速检测分析系统(法国生物梅里埃股份有限公司)；杜邦BAX Q7、miniVIDAS(法国生物梅里埃股份有限公司)；Autof ms1000(安图生物)。

1.3 菌种

微生物限度检查法用标准菌株：金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]；大肠埃希菌(Escherichiacoli) [CMCC(B)44102]，在中国食品药品检定研究院购买，实验室传代保藏。

1.4 试剂

冻干兔血浆(青岛高科园海博生物技术有限公司，批号：6333802);REAL-TIME PCR AssayStaphylococcusaureu(美国杜邦，批号Q8114);VITEK2 CP、GN鉴定卡(法国梅里埃，批号：2420735203、2410627103)；VIDAS金黄色葡萄球菌测试试剂盒(法国梅里埃，批号：1006051870)。

1.5 培养基

SCDLP液体培养基(青岛高科园海博生物技术有限公司，批号：6333802)；Baird-Parker琼脂(郑州贝瑞特，批号：0011916)；血平板(郑州贝瑞特批号：0011916)；胰酪大豆胨琼脂平板(广东环凯微生物科技有限公司，批号：J0167Y)；甘露醇发酵培养基(青岛高科园海博生物技术有限公司，批号：20170509)，以上培养基均进行培养基适用性试验合格后使用。

2 方法与结果

2.1 国标法

2.1.1 样品前处理 样品的西林瓶在生物安全柜中打开，无菌操作向西林瓶中加入6 mL SCDLP,将样品完全混匀，使其分散混悬，转移到灭菌的试管中，然后再用SCDLP润洗西林瓶4次，每次1 mL，最终试管中SCDLP体积为10 mL。

2.1.2 增菌培养 上述稀释液作为增菌液，于36 ℃培养24 h。

2.1.3 分离培养 从上述增菌培养液中，取1环划线接种在Baird Parker平板上，置36 ℃培养48 h。划线接种血平板，置36 ℃培养24 h。

2.1.4 纯化培养 挑取疑似单个菌落在血琼脂平板上，置36 ℃培养24 h。挑取血平板上疑似单个菌落在胰酪大豆胨琼脂平板上进一步纯化，置36 ℃培养24 h。

2.1.5 染色镜检 挑取纯化的可疑菌落，涂片，革兰染色。

2.1.6 甘露醇发酵试验 取上述分纯的菌落接种到甘露醇发酵培养基中，在培养基液面上加入高度为2～3 mm的灭菌液体石蜡，置36 ℃培养24 h，发酵甘露醇产酸溶液颜色变黄者为阳性。

2.1.7 血浆凝固酶试验 取冻干兔血浆西林瓶，无菌操作加入0.5 mL生理盐水，再加入疑似菌24 h肉汤培养物0.3 mL，混匀，置36 ℃培养箱中，每半小时观察1次，6 h之内呈现凝块即为阳性。

2.1.8 检验结果报告 在上述选择平板上有可疑菌落生长，经染色镜检，证明为革兰阳性葡萄球菌，并能发酵甘露醇产酸，血浆凝固酶试验阳性者，可报告被检样品检出金黄色葡萄球菌。结果见表1。CODE1在血平板上有白色圆形光滑，无溶血圈疑似菌落，镜检为革兰阳性球菌，甘露醇发酵试验和血浆凝固酶试验均为阴性，所以判定未检出金黄色葡萄球菌。CODE2在血平板上有金黄色圆形光滑，周围有溶血圈疑似菌落，镜检为革兰阳性球菌，甘露醇发酵试验和血浆凝固酶试验均为阳性，所以判定检出金黄色葡萄球菌。实验同时做阳性对照为阳性结果，阴性对照为阴性结果。

2.2 VITEK2 Compact鉴定

挑取“2.1.4”项下方法纯化的单个菌落，鉴定根据菌落形态、革兰染色结果，按照仪器说明书配置一定浓度的菌悬液，接种相应的鉴定卡，上机检测。结果见表2。CODE1中分离出疑似菌落1，非疑似菌落2和菌落3，利用VITEK2 Compact鉴定结果分别为表皮葡萄球菌、泛菌属、单核细胞增生李斯特菌，结论为未检出金黄色葡萄球菌。CODE2中分离出疑似菌落1，非疑似菌落2和菌落3，利用VITEK2 Compact鉴定结果分别为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门菌属，结论为检出金黄色葡萄球菌。

2.3 杜邦BAX Q7鉴定

取“2.1.2”的增菌液5 μL，加入裂解液200 μL，55 ℃保持1 h，95 ℃保持10 min，立即冷却5 min，取50 μL加入PCR管条中，上机检测。结果见表3。杜邦BAX Q7鉴定结果：CODE1为“-”，即未检出金黄色葡萄球菌。CODE2为“+”，即检出金黄色葡萄球菌。同时做阳性对照结果为“+”，阴性对照结果为“-”。

2.4 miniVIDAS鉴定

仪器定标后，取“2.1.2”的增菌液2 mL，使用水浴灭活，取0.5 mL加入试剂条第1个加样孔，放入SPR管上机鉴定。结果见表3。miniVIDAS鉴定结果：CODE1为“-”，即未检出金黄色葡萄球菌。CODE2为“+”，即检出金黄色葡萄球菌。同时做阳性对照结果为“阳性”，阴性对照结果为“阴性”。

2.5 MALDI-TOF质谱鉴定

安图生物的全自动微生物质谱检测系统，型号：Autof ms1000。处理方法如下:在1.5 mL离心管中加入300 μL去离子水。取“2.1.4”项下纯化的单个菌落于离心管中，充分振荡混匀。加入900 μL无水乙醇，充分混匀。室温离心2～4 min(转速13 000 r/min)，倒去上清，再次离心，使用移液枪完全除去上清。37～40 ℃干燥沉淀2～5 min，至沉淀表面无明显水迹。加入10 μL裂解液1，充分混匀。加入10 μL等体积的裂解液2，充分混匀。室温离心2～4 min(转速13 000 r/min)。吸取1 μL上清液，滴加到样品靶上，晾干至样品点无明显水迹。取1 μL基质溶液覆盖在上述样品点上，晾干至样品点无水迹。上机检测。结果见表4。CODE1中分离出疑似菌落1，非疑似菌落2和菌落3，利用MALDI-TOF质谱鉴定结果分别为表皮葡萄球菌、阪崎克洛诺杆菌、单核细胞增生李斯特菌，结论为未检出金黄色葡萄球菌。CODE2中分离出疑似菌落1，非疑似菌落2和菌落3，利用MALDI-TOF质谱鉴定结果分别为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门菌属，结论为检出金黄色葡萄球菌。

2.6 结果比较

国标法的鉴定主要靠传统的手工生化法，结果受人员的操作和判定有很大的影响。其他4种仪器法采用不同的原理对样品进行鉴定，大大缩短了检出时间，减少了人为因素的影响，但需要仪器和试剂成本有所提高。5种方法的结果见表5，比较发现结果均一致。CODE1均未检出金黄色葡萄球菌，CODE2均检出金黄色葡萄球菌。

表1 国标法试验结果Table 1 Results of national standard method

注：阳性对照为金黄色葡萄球菌，阴性对照为大肠埃希菌。

表2 VITEK2 Compact鉴定结果Table 2 Results of VITEK2 Compact

表3 杜邦BAX Q7和miniVIDAS鉴定结果Table 3 Results of BAX Q7 and miniVIDAS

注：阳性对照为金黄色葡萄球菌，阴性对照为大肠埃希菌。

表4 MALDI-TOF质谱鉴定结果Table 4 Results of MALDI-TOF MS

表5 5种鉴定方法结果Table 5 Results of five identification methods

3 讨论

检验机构的检测能力是评价实验室能力重要条件[5]。为了加强药品化妆品微生物检测质量的控制，提高本检验机构微生物检测能力，特进行此次验证活动。盲样中除可能添加目标菌金黄色葡萄球菌外，还会添加多种其他菌以干扰阳性菌的检出。各种细菌具有不同的酶系统，对营养基质的分解能力也不一样，国标法利用生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属。由于许多不同种属菌在相同选择性培养基上有相似或相同的菌落形态，如试验中干扰菌与金黄色葡萄球菌在血平板上有极相似的形态，这就导致传统国标法非常依赖检验人员经验能力，很容易出现漏检、假阴性结果出现。并且传统国标法通常至少需要5～7 d时间，试验周期过长。所以使用仪器进行辅助有助于提高检出率和结果的准确性[6-10]。

为缩短试验时间，实现快速鉴定。越来越多的现代分子生物学手段和仪器运用到了细菌种属鉴定上。杜邦BAX Q7采用实时定量荧光PCR 技术检测微生物，miniVIDAS利用酶联免疫的原理对微生物或毒素等进行筛选检测。两种方法都是增菌后即可进行检测，30 h左右就可得到试验结果，大大缩短了试验周期，而且准确率高，不容易出现假阴性结果。

为满足更多的工作需要，本实验室不仅仅停留在目标菌检出或未检出的层面，而是有能力鉴定出样品中筛选到的所有菌。上述3种鉴定手段显然已经不能满足我们的需要。VITEK2 Compact和MALDI-TOF MS则能很好地解决这一问题。仪器法中VITEK2 Compact利用集成了众多的生化试验的鉴定卡，根据实验结果与数据库比对得出结论。MALDI-TOF MS是近年发展起来的一种软电离技术，通过细菌的蛋白质指纹图谱与数据库中已知菌种的标准图谱进行比对，几分钟内就可以完成鉴定。上述两种方法都可鉴定出金黄色葡萄球菌和筛出的所有干扰菌种属，通量高，准确性好。但试验中发现，这两种方法都依赖数据库比对，由于各自公司数据库容量不同，对于一些不常见种属的细菌种属鉴定上可能存在差异。如CODE1的菌落2，VITEK2的鉴定结果为泛菌属(Pantoeaspp)，而MALDI-TOF MS鉴定结果则为阪崎克洛诺杆菌(Cronobactersakazakii)。出现这种情况时，就需要通过16SrRNA基因测序方法进行进一步鉴定[11-14]。

综上所述，根据不同的试验目的可以选择不同的试验方法。本实验室建立的药品化妆品微生物致病菌检测程序如下：盲样经增菌后，划线分离的同时可以先使用杜邦BAX Q7和miniVIDAS进行初筛。根据初筛的结果更有针对性的从分离培养基中挑取疑似的和非疑似的菌落，分别利用国标法、VITEK2 Compact和全自动微生物质谱检测系统Autof ms1000对其进行鉴定。以期通过多种实验手段互相佐证，得出最全面最准确的结果。