生长激素改善多囊卵巢综合症患者卵母细胞成熟度的研究

吴正中，李雪梅*，刘兰云，成艳君，王萍

(1.南方医科大学附属深圳妇幼保健院，深圳 518000；2.深圳市龙岗区妇幼保健院，深圳 518000)

IVF-ET是临床治疗患者不孕不育的重要方法，其首要环节是利用超生理剂量的Gn进行控制性促排卵(COH)。获得足够数量和质量的卵母细胞是临床IVF-ET治疗取得成功的先决条件，而患者COH过程中对外源Gn刺激的反应性决定了临床可获得卵母细胞的数量和质量[1]。当前，患者COH过程中出现的卵泡发育和卵母细胞成熟障碍是临床应用IVF-ET技术不得不面对的常见难题。因此，如何优化临床COH方案，增强患者卵巢组织对外源Gn的反应性仍然是临床亟待解决的重要课题。

现有的研究表明，在卵巢反应不良患者的COH过程中添加外源生长激素(GH)协同Gn作用，能明显改善卵巢组织对外源Gn的反应性，促进卵泡募集，提高获卵数和卵母细胞成熟度，并最终改善胚胎培养的结局[2]。但目前该方案对多囊卵巢综合症(PCOS)患者的有效性缺乏必要的研究支持。本研究通过观察外源GH在COH过程中的辅助应用对PCOS患者卵母细胞发育成熟和体内相关激素与细胞因子分泌及特定基因表达的影响，揭示外源GH在COH过程中改善PCOS患者卵母细胞成熟度的应用价值及其初步机制。

资料和方法

一、研究对象及分组

选择2016年9月至2019年1月在深圳市妇幼保健院生殖医学中心利用卵胞浆内单精子注射(ICSI)技术进行不孕治疗的PCOS患者75例。根据患者促排卵过程中是否使用外源GH，将其分成两组：使用GH组(44例)和未使用GH组(31例)。所有入选病例均满足Rotterdam诊断标准(2003)[3]，排除有以下任何一种情况者：(1)有子宫内膜异位症、甲状腺功能减退症、高泌乳素血症、先天性肾上腺皮质增生症或既往卵巢手术史等其他影响生育能力的疾病；(2)男女任何一方染色体异常。所有患者知情同意，并经本院医学伦理委员会批准后启动研究。

二、方法

1.促排方案：进入治疗前一月经周期给予口服避孕药，至服药第15天开始用达菲林(0.05 mg/d，益普生，法国)皮下注射至HCG注射日，一般用药14～18 d后可达到垂体降调节目的(满足条件：子宫内膜≤5 mm，血清E2水平<110 pmol/L，LH<5 U/L，双侧卵巢卵泡直径<5 mm)。在月经周期第2～5天开始给予丽申宝(上海丽珠)促排卵，起始用药剂量75～112.5 U/d，而后依据B超监测卵泡发育情况调整给药剂量。对选择使用GH的PCOS患者，在开始使用丽申宝的同时注射重组生长激素珍怡(上海联合赛尔生物)4 U/d，直至HCG日。当超声监测50%卵泡平均径线≥17～18 mm时，当日采集患者静脉血并肌肉注射人绒毛膜促性腺激素(HCG，上海丽珠)10 000 U。36 h后，经阴道B超引导下取卵，并收集卵泡液和颗粒细胞。

2.卵母细胞体外培养与授精：取卵获得的卵丘-卵母细胞复合体于捡卵皿(G-IVF plus，Vitrolife，瑞典)中经37℃ 、 6% CO2、5% O2和 89% N2培养箱体外培养3～4 h后，利用透明质酸酶(Vitrolife，瑞典)脱去卵周颗粒细胞，并对所有的MⅡ卵行ICSI授精。余下的MⅠ和GV卵同等条件下继续体外培养16 h，对培养成熟的MⅡ卵行ICSI授精。记录并比较两组患者在体外继续培养前后MⅡ卵数、MⅠ卵数、GV卵数、总MⅡ卵率、ICSI受精率、卵裂率和优胚率及治疗周期取消率的差异。

3.激素与核酸检测：将收集到的血液和卵泡液经2 000 r/min 离心10 min 后取上清液，置于-80℃冰箱保存，等待统一送检。采用全自动化学发光法检测血清和卵泡液中E2、GH及胰岛素样生长因子-I(IGF-I)含量。荧光定量PCR法检测取卵日收集的卵巢颗粒细胞上IGF-1R mRNA、GHR mRNA和StAR mRNA的基因表达量。

三、统计学分析

结 果

一、一般资料比较

两组患者的年龄、体重指数(BMI)、血清基础性激素和抗苗勒氏管激素(AMH)水平、中重度卵巢刺激综合征(OHSS)的发生率及进行ICSI的病因组成均无显著性差异(P>0.05)，而使用Gn天数和Gn总剂量存在统计学差异(P<0.05)。因无可用胚胎、子宫内膜差或预防OHSS等原因，两组取消新鲜移植的患者数分别为22例和23例，使用GH组患者的周期取消率显著低于未使用GH组患者(P<0.05)(表1)。其余患者经Day3移植2枚优质卵裂胚后，使用GH组15例获得临床妊娠，而未使用GH组3例获得临床妊娠，两组的临床妊娠率分别为68.2%和37.5%。

表1 两组患者一般资料比较[(-±s)，%]

注：与未使用GH组比较，*P<0.05

二、外源GH对PCOS患者卵母细胞发育成熟的作用

取卵后离体的卵母细胞经体外培养3～4 h后，比较两组患者的MⅡ卵数、MⅠ卵数、GV卵数和总MⅡ卵率，发现COH过程中使用GH组患者的MⅡ卵数和总MⅡ卵率均显著高于未使用GH组患者(P<0.05)，而MⅠ卵数和GV卵数均显著低于后者(P<0.05)。ICSI授精后观察两组患者受精、卵裂和胚胎发育情况，发现与未使用GH组相比，使用GH组患者的正常受精率、卵裂率和优胚率均显著增高(P<0.05)。将ICSI授精后余下的未成熟卵经体外继续培养16 h后，不仅每组患者的MⅡ卵数、MⅠ卵数和GV卵数均低于继续培养前的对应值，而且其总MⅡ卵率、正常受精率、卵裂率和优胚率也均显著低于后者的对应值(P<0.05)；但继续体外培养后各指标在两组患者间均没有显著差异(P>0.05)(表2)。

三、外源GH对PCOS患者血液与卵泡液中GH、E2和IGF-1水平的影响

利用全自动化学发光法检测HCG日血清和取卵日卵泡液中E2、GH及IGF-I含量，发现两者中的GH和IGF-1含量无显著性差异(P>0.05)，而血清E2含量显著低于卵泡液(P<0.05)。使用GH组患者血清和卵泡液中上述各指标值均高于未使用GH组患者，其中两组间血清与卵泡液GH和IGF-1及卵泡液E2的差异具有统计学意义(P<0.05)(表3)。

表2 两组患者卵母细胞发育成熟及授精后结局的比较[(-±s)，%]

注：与未使用GH组比较，*P<0.05；与继续培养前的同组别相比，#P<0.05

表3 两组患者血清和卵泡液E2、GH及IGF-I含量的比较(-±s)

注：与未使用GH组比较，*P<0.05；与同组血清中的含量相比，#P<0.05

四、外源GH对PCOS患者卵巢颗粒细胞上GHR mRNA、IGF-1R mRNA和StAR mRNA基因表达的影响

类固醇合成快速调节蛋白(StAR)在甾体激素合成限速步骤中起关键性作用[4]。为了分析外源GH在卵泡发育、卵母细胞成熟和甾体激素合成过程中的作用方式，本研究进一步检测了两组患者卵巢颗粒细胞上GH受体基因GHR mRNA、IGF-1受体基因IGF-1R mRNA和类固醇合成快速调节蛋白基因StAR mRNA的表达水平，发现COH过程中使用GH组其取卵日卵巢颗粒细胞上GHR mRNA、IGF-1R mRNA和StAR mRNA的表达较之未使用GH组均显著增多(P<0.05)(图1)。

五、卵泡液GH含量与其它指标的相关性分析

结果呈现，卵泡液中GH含量与卵泡液IGF-1和E2水平、MⅡ卵数及颗粒细胞GHR mRNA、IGF-1R mRNA和StAR mRNA相对表达量均显著正相关(P<0.05)。此外，卵泡液IGF-1与卵泡液E2、MⅡ卵数及颗粒细胞GHR mRNA、IGF-1R mRNA和StAR mRNA相对表达量，以及卵泡液E2与MⅡ卵数和颗粒细胞StAR mRNA呈现显著正相关关系(P<0.05)(表4)。

与未使用GH组相比，*P<0.05

表4卵泡液GH含量与其它指标的相关性分析

卵泡液GH卵泡液IGF-1卵泡液E2MⅡ卵数颗粒细胞GHR mRNA颗粒细胞IGF-1R mRNA颗粒细胞StAR mRNA卵泡液GH10.715∗∗0.268∗0.243∗0.710∗∗0.610∗∗0.239∗卵泡液IGF-10.715∗∗10.406∗∗0.268∗0.870∗∗0.633∗∗0.238∗卵泡液E20.268∗0.406∗∗10.358∗∗0.1310.1690.443∗∗MⅡ卵数0.243∗0.268∗0.358∗∗10.1630.0400.230颗粒细胞GHR mRNA0.710∗∗0.870∗∗0.1310.16310.577∗∗0.242∗颗粒细胞IGF-1R mRNA0.610∗∗0.633∗∗0.1690.0400.577∗∗10.035颗粒细胞StAR mRNA0.239∗0.238∗0.443∗∗0.2300.242∗0.0351

注：*在0.05水平(双侧)上显著相关;**在0.01水平(双侧)上显著相关

讨 论

GH是一种蛋白质多肽类激素，主要由垂体前叶分泌，具有促进机体生长发育和细胞增殖等多种生理功能，能够在女性生殖系统发育过程中发挥重要作用。GH分泌不足的女性可出现青春期延迟或成年后卵巢对Gn的反应性下降。在卵巢反应不良患者的COH过程中添加外源GH能够以更低的Gn使用剂量和更短的使用时间促进卵泡发育和卵母细胞成熟[5]，增加MⅡ卵数量，并显著提高受精率[6-7]、优胚率[8]、可移植胚胎数[9]和临床妊娠率[10]。

PCOS患者存在内在性卵泡发育和卵母细胞成熟障碍，常导致COH后的卵母细胞成熟率较低。为了探讨添加外源GH的COH方案对改善PCOS患者卵母细胞发育成熟及其胚胎体外发育潜能的有效性，本研究比较了使用GH组PCOS患者与未使用GH组PCOS患者的卵母细胞离体培养3～4 h后其各自MⅡ卵数、MⅠ卵数、GV卵数、总MⅡ卵率和ICSI受精率及受精后胚胎发育情况的差异，发现与未使用GH组患者相比，使用GH组患者的MⅡ卵数、总MⅡ卵率、ICSI正常受精率、卵裂率和优胚率均显著升高(P<0.05)，而MⅠ卵数和GV卵数均显著降低(P<0.05)。说明使用GH组患者得到的卵母细胞成熟度更高且其受精能力和胚胎发育潜能更好，提示该COH方案同样适用于PCOS患者。此外，本研究发现COH过程中使用外源GH同样能减少PCOS患者的Gn使用天数和总使用剂量，与刘珍等[11]结果存在差异，可能与研究所选的病例构成不同有关。

GH的作用过程复杂，目前尚不清楚外源GH在COH过程中起作用的具体机制。以往的研究表明，GH能通过受体-配体途径或IGF-1介导的途径来促进卵泡发育、甾体激素合成和卵母细胞成熟[12]。本研究发现使用外源GH的患者其血清和卵泡液GH、IFG-1和E2含量均增高，其中血清和卵泡液GH和IGF-1及卵泡液E2含量的变化具有统计学意义(P<0.05)，且卵泡液GH含量与卵泡液IGF-1和E2含量及MⅡ卵数显著正相关，证实了外源GH的使用与患者卵泡发育、甾体激素合成和卵母细胞成熟等功能增强的关联性。同时，通过检测卵巢颗粒细胞GH受体GHR和IGF-1受体IGF-1R的表达水平，发现取卵日使用GH组患者卵巢颗粒细胞GHR mRNA和IGF-1R mRNA的表达水平均显著高于未使用GH组(P<0.05)，且卵泡液GH和IGF-1含量与颗粒细胞GHR mRNA和IGF-1R mRNA表达水平正相关。说明外源GH的使用提高了PCOS患者卵泡液的GH含量，后者通过上调其受体基因GHR mRNA的表达，增强了配体-受体通路活性，进而促进了机体对IGF-1及其受体的合成与分泌。研究表明，GH和IGF-1含量升高可以独自或相互协同提高卵巢对Gn的敏感性，促进卵泡发育和卵母细胞成熟[5]；GH上调受体基因的表达能调节线粒体活性和(或)细胞内钙稳态，进而提高卵母细胞质量[1，13]，且卵母细胞所处的卵泡液中GH含量越高，形成的胚胎质量越好[14]；而升高的IGF-1还能够抑制卵泡凋亡[15]，增强卵泡刺激素和芳香化酶活性，从而促进卵泡发育和甾体激素合成与转化。

然而，进一步比较ICSI授精后余下的未成熟卵在体外同等条件下继续培养16 h后的卵母细胞成熟度及成熟MⅡ卵ICSI授精和培养结局，发现此时两组患者的总MⅡ卵率、ICSI正常受精率、卵裂率和优胚率均显著低于继续培养前的对应值(P<0.05)，但两组间比较，差异没有统计学意义(P>0.05)。说明体外成熟的卵母细胞其成熟度、受精能力和胚胎发育潜能均显著低于体内成熟的卵母细胞，且不受COH过程中是否使用GH的影响。提示外源GH改善卵母细胞成熟度的作用依赖于配体-受体途径及IGF-1介导的途径所建立的激素和细胞因子微环境。

需要指出的是，尽管本研究发现添加外源GH的COH方案能够显著改善PCOS患者卵母细胞成熟度及其胚胎体外发育潜能，但鉴于PCOS患者的临床复杂性，是否对每位PCOS患者或者对哪些特定患者建议采用该种COH方案值得进一步研究。