CD47及CRT在人稽留流产蜕膜组织中的表达及意义

石峻，赵红敏

(西安市第九医院 1．妇产科；2.超声医学科，西安 710054)

稽留流产(MA)是指胚胎或胎儿死亡后仍滞留宫腔内未能自然排出，又称过期流产，多发生于妊娠12周以内，可导致弥散性血管内凝血(DIC)，发生凝血功能障碍，是一种较难处理的病理性妊娠类型[1]。MA病因复杂，与胚胎或胎儿染色体异常、母-胎界面免疫失衡、母体生殖道感染、母体内分泌异常、细胞增殖凋亡异常、子宫胎盘循环障碍、心理状态等有关[2]。有研究认为[3]，除了胚胎或胎儿染色体异常导致早期流产这一常见因素，母-胎界面免疫失衡引起母体对胚胎的免疫排斥也是导致MA发生的重要因素。近年来母-胎界面脱膜组织在MA发病机制中的研究受到重视。受精卵着床后子宫内膜间质受蜕膜化诱导因子刺激增殖和再分化形成蜕膜组织，其功能的正常表达对妊娠建立与维持及分娩发动极为重要[4]。有研究显示[5]，蜕膜组织中存在多种蛋白，其表达水平的差异对MA造成的影响不尽相同。CD47是一种广泛表达于各种细胞表面膜蛋白，参与β3整合素介导的信号通路，对细胞生长、凋亡及迁移、血小板激活、细胞粘附、改变血管通透性等发挥作用[6]。钙网蛋白(CRT)是内质网(ER)主要的钙结合蛋白，根据其生物学功能可分为CRT的佐剂效应、胞外CRT的功能、细胞膜表面CRT的功能和内质网相关功能四个方面；CRT对维持Ca2+稳态、协助蛋白质的折叠和加工、抑制血管生成、参与抗原提呈、细胞调亡等具有重要意义[7]。然而，关于CD47和CRT在人稽留流产胎膜组织中有无表达，及其之间是否存在一定关联，目前未见报道。为此，本次研究通过对人稽留流产蜕膜组织中的CD47及CRT两种蛋白进行检测，观察其表达情况。现报道如下：

资料与方法

一、研究对象

1.一般资料：选取2017年6月至2018 年10 月我院妇产科收治并诊断为稽留流产的40例患者资料进行研究，纳入同期行人工流产的正常早孕患者为对照组(42例)。

2.稽留流产的诊断标准：(1)早孕反应消失，有先兆流产症状(阴道出血)或无任何症状；(2)子宫不再增大反而缩小，至妊娠中期时胎动消失或无胎动；(3)经妇科检查可见宫颈口闭合，子宫较停经周数小、质地较硬，无胎心；(4)B超检查发现子宫腔内胚囊不规则，囊内反射波紊乱，无胎心搏动；(5)实验室检查发现孕妇血清孕酮及绒毛膜促性腺激素(HCG值)低于正常值；(6)尿妊娠试验呈阴性。

3.纳入标准：(1)两组孕妇年龄均在18～45 岁之间，妊娠时间均为6～12 w；(2)无全身感染性疾病及其他合并症，流产前无任何用药史；(3)既往无自然流产及死胎史，均为单胎妊娠早期流产；(4)月经周期规律，均无生殖系统异常、产道感染；(5)宫腔形态正常，无宫腔粘连、子宫畸形等子宫器质性病变等。

4.排除标准：(1)既往有习惯性流产史；(2)有肿瘤病史及妊娠期合并症；(3)有家族遗传病或系统性疾病等。

5.试剂及标本收集：SP免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒(北京中杉金桥)，兔抗重组人CRT抗体(Santa Cruz，美国)，兔抗人CD47抗体(Santa Cruz，美国)。标本收集：在患者排除感染期疾病后行常规消毒、麻醉，取膀胱截石位，利用彩色多普勒进行孕囊确认及扩宫，通过腹部B超引导，负压吸引妊娠囊行刮宫术并收集其清除组织，将部分所得组织投入95%酒精中固定然后送至病理检查，待蜕膜分离后利用4%多聚甲醛固定12～24 h。再将固定好蜕膜组织置于组织盒并放入全自动组织脱水机常规脱水、浸蜡，并用石蜡包埋，待检。

二、方法

1.Western Blot检测两组患者蜕膜组织中CD47和CRT的表达情况：制备12%分离胶和6%浓缩胶，进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，用丽春红S染液复染5 min，水中脱色，标记目的蛋白位置后，用蒸馏水洗涤5 min×3次，至完全脱色。将目的蛋白的NC膜条带放入含5%脱脂奶粉的PBST缓冲液中，室温下封闭2 h，取出NC膜，加入1∶500倍稀释的一抗，室温下缓慢摇动孵育4 h。然后PBST洗涤5 min×3次。然后加入1∶8 000倍稀释的二抗，室温下缓慢摇动孵育1 h，PBST洗涤5 min×3次，采用化学发光法，统计灰度值。

2.SP法检测两组患者蜕膜组织中CD47及CRT的表达情况：免疫组化SP法实验方法[8]，石蜡切片，厚度约5 μm，常规脱蜡，采用1 500 ml柠檬酸盐抗原修复，磷酸缓冲盐溶液(PBS液)震荡漂洗5 min，3次；然后进行免疫组织化学染色：滴加过氧化物酶(3% H2O2)阻断试剂，室温孵育20 min，滴加山羊血清工作液50 μl，室温封闭20 min；滴加一抗50 μl/片，4℃恒温箱过夜；加入生物素标记的二抗50 μl/片，37℃孵育30 min；加入辣根酶标记链酶卵白素工作液50 μl/片，37℃孵育30 min；PBS液漂洗，加入1～2滴DAB 液染色3～10 min，显微镜下观察显色情况；后将切片投入苏木素染液复染5 min，滴加中性树胶封片，干燥备用，记录染色结果。对照组试验用PBS 缓冲液代替一抗，其余操作过程同上。SP免疫组化染色法判定标准：依据显微镜下细胞核、胞浆或间质有黄色、棕黄色或深褐黄色颗粒判断为阳性细胞。选取两组患者蜕膜组织切片标本于显微镜下随机观察10个视野范围(×400)，使用I mage Pro Plus图像分析系统测算，绘制两组患者蜕膜组织阳性区域CRT及CD47的积分光密度值(IOD值)及IOD/Area值，分析其相关性。

三、统计学分析

结 果

一、一般资料比较

稽留流产组(40例)：孕妇年龄21～38 岁，平均(25.6±2.5)岁；孕龄6～12 w，平均(9.7±1.6)w；BMI指数(23.4±3.1)kg/m2。对照组(42例)，孕妇年龄23～42岁，平均(26.1±2.3)岁；孕龄7～11 w，平均(8.5±1.3)w；BMI指数(22.7±3.9)kg/m2。两组患者年龄、孕周等一般基本资料无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

二、Western Blot检测两组蜕膜组织中CD47和CRT的表达

结果表明，与对照组比较，稽留流产组患者蜕膜组织中CRT表达极显著升高，CD47表达极显著下降(P<0.01)(图1)。

A：Western Blot检测条带图；B：两组蜕膜组织中CD47相对表达情况；C：两组蜕膜组织中CRT相对表达情况。与对照组相比较，**P<0.01

三、SP法检测两组蜕膜组织中CD47和CRT的表达情况

CRT在脱膜组织中定位于细胞浆及胞膜呈阳性表达，稽留流产组患者蜕膜组织中CRT表达升高且高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)(图2)。CD47在蜕膜组织中定位于细胞浆及胞膜呈阳性表达，稽留流产组患者蜕膜组织中CD47表达下降且低于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)(图3)。

A：两组蜕膜组织中CRT免疫组化图；B：两组蜕膜组织单位面积内CRT浓度。与对照组相比较，**P<0.01

A：两组蜕膜组织中CD47免疫组化图；B：两组蜕膜组织单位面积内CD47浓度。与对照组相比较，**P<0.01

四、两组患者蜕膜组织中CRT及CD47的IOD值

稽留流产组患者蜕膜组织中CRT的IOD值显著高于对照组，CD47的IOD值显著低于对照组(P<0.01)。对两组患者CRT与CD47的IOD值采用Pearman相关性分析，结果显示稽留流产组40例患者蜕膜组织中CRT与CD47的IOD值呈负相关(r=-0.648，P=0.012)，对照组患者蜕膜组织中CRT与CD47的IOD值呈正相关(r=0.324，P=0.023)(表1)。

表1 两组患者蜕膜组织中CRT及CD47表达(-±s)

讨 论

MA是临床中较常见的一种流产类型，近年来其发生率高达13.4%，发病机制尚不明确，降低MA的发生率，预防不良妊娠结局发生，对我国优生优育有着深远的意义。蜕膜组织使母体和胎儿建立密切联系，胚胎通过蜕膜组织从母体获得营养物质。子宫蜕膜功能的正常表达在妊娠过程中非常重要，当蜕膜组织微环境被破坏后，可能使母体对胎儿无法耐受，发生免疫排斥导致流产的发生，因此，母-胎界面免疫失衡可能是诱发MA的重要因素。CD47参与胚胎植入和发育、使蜕膜增殖分化与凋亡、促进胎盘新生血管的形成等，其表达异常会导致免疫调节失衡，阻碍胎盘新生血管形成，从而导致不良妊娠结局[8]；CRT表达异常可抑制血管的生成，增强吞噬细胞活性，介导细胞凋亡和清除。有文献报道[9]，凋亡细胞膜表面CRT升高的同时，伴随CD47表达量的明显下降，两者共同作用可增强吞噬细胞的吞噬效率。

CD47与SIRPα结合通过抑制巨噬细胞的活性，保证自身正常细胞不被巨噬细胞吞噬[10]。CD47表达缺失可能会增加巨噬细胞活性和胎盘血管的形成障碍，导致母体对胎儿发生免疫排斥，从而导致MA发生[11]。研究采用Western Blot法对两组患者蜕膜组织中CD47和CRT的表达情况进行检测发现，与对照组比较稽留流产组患者蜕膜组织中CRT表达升高，CD47表达下降，统计有显著性差异(P<0.01)。免疫组化SP法检测发现CD47在蜕膜组织中定位于细胞浆及胞膜呈阳性表达，与对照组比较，稽留流产组蜕膜组织中CD47表达下降且显著低于对照组(P<0.01)。说明CD47低表达会影响母-胎界面免疫失衡，在MA的发生过程中可能起到了推动作用。细胞凋亡早期，细胞膜表面CRT的出现要早于磷脂酰丝胺酸(PS)，细胞凋亡时，CRT会由细胞内转向细胞膜表面，并密集分布，这种异常表达和存在于巨噬细胞表面的受体相关蛋白(LDL)结合，向巨噬细胞发出信号，以便及时清除凋亡细胞，避免局部炎症反应的出现[12-13]。在关于妊娠小鼠蜕膜CRT表达的试验结果显示[14]，妊娠小鼠的脱膜组织中和未孕小鼠的子宫内膜中均存在CRTmRNA的表达，妊娠小鼠脱膜组织中CRT水平显著高于未孕小鼠子宫内膜组织，小鼠在妊娠第4～5 d时CRT达到高峰，之后CRT下降，说明CRT对胚胎植入可能发挥一定作用。也有研究表明CRT对小鼠胚胎的心脏发育有一定影响，正常情况下CRT在小鼠妊娠的第9天左右被激活，第18天后CRT表达开始减弱；而在CRT过度表达的小鼠或存在CRT基因缺陷的小鼠中，其心肌厚度病理改变，最终小鼠胚胎因心脏功能紊乱而死亡[15]。研究中显示，CRT在两组脱膜组织中也定位于细胞浆及胞膜呈阳性表达，稽留流产组患者蜕膜组织中CRT表达升高且显著高于对照组(P<0.01)。说明在胚胎着床后MA患者蜕膜组织中CRT合成增加，可能导致CRT由细胞内质网转移至细胞表面，从而释放大量的吞噬信号，增加了巨噬细胞活性，同时CRT的增高，抑制了血管生成，介导细胞凋亡，对MA的发生起到推动作用。此外，研究中通过分析两组蜕膜组织中CD47及CRT的IOD值发现，稽留流产组患者蜕膜组织中CRT的IOD值高于对照组，CD47的IOD值显著低于对照组(P<0.01)；并对两组患者CRT与CD47的IOD值采用Pearman相关性分析，结果显示稽留流产组40例患者蜕膜组织中CRT与CD47的IOD值呈负相关(r=-0.648，P=0.012)，对照组患者蜕膜组织中CRT与CD47的IOD值呈正相关(r=0.324，P=0.023)。说明CRT与CD47的平衡表达可能对母-胎界面免疫环境的稳定和免疫耐受过程具有重要作用；本研究仅对蜕膜组织的CRT、CD47进行半定量检测，结果说明CRT、CD47可能与MA存在一定关联。母-胎界面存在多种免疫活性细胞，其究竟是通过脱膜基质细胞/脱膜免疫细胞还是滋养细胞参与母-胎界面平衡，仍需进一步研究。

综上所述，蜕膜组织中CRT、CD47的异常表达，可能对MA进程发挥作用。